Einfluss von Umweltfaktoren auf die Regulation der Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17

Speck, Nancy

Die Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17 sind für die Proteolyse diverser Zelladhäsionsmoleküle, Wachstumsfaktoren, Zytokine und auch von deren Rezeptoren verantwortlich, welche in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Aus diesem Grund steht die Regulation der Proteasen in einem besonderen Fokus vieler Forschergruppen. Gleichzeitig rückte in den letzten Jahren auch der Einfluss von Umweltfaktoren auf verschiedene zelluläre Prozesse und die Entstehung von beispielsweise inflammatorischen Erkrankungen zunehmend in den Mittelpunkt. Inwiefern diese Faktoren auch die Metalloproteasen beeinflussen könnten, ist bislang jedoch noch kaum untersucht. Im Hauptteil der vorliegenden Arbeit wurde daher der Frage nachgegangen, inwieweit Fettsäuren aus der Nahrung ADAM10 und ADAM17 in einem Mausmodell der Atherosklerose (low density lipoprotein-Rezeptor-Knock-out, LDLR-/-) regulieren. Eine wichtige Rolle beider Proteasen in der Atherogenese ist wahrscheinlich, da sie für die Prozessierung einer Reihe von Entzündungsmediatoren und Zelladhäsionsmolekülen verantwortlich sind, die in die Entstehung der Atherosklerose involviert sind. Zahlreiche Studien zeigten in der Vergangenheit, dass Fischöl, welches reich an mehrfach ungesättigten Omega-3-Fettsäuren ist, protektiv auf die Atherogenese wirkt. Dies konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden. Hier wurden Wildtyp- und LDLR-/--Mäuse mit einer fettreichen Diät gefüttert, deren Fettanteil entweder hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren (Schweineschmalz) bestand oder mit Fischöl angereichert war. Es konnte gezeigt werden, dass Fischöl-reiche Nahrung zu weniger atherosklerotischen Plaques in den Aorten der LDLR-/--Mäuse führte, als eine Schweineschmalz-angereicherte Diät. Dieser anti-atherogene Effekt von Fischöl konnte nicht auf eine verminderte systemische Inflammation zurückgeführt werden, da die Konzentration zirkulierender inflammatorischer Marker nicht beeinflusst wurde. Die Reduktion atherosklerotischer Läsionen korrelierte jedoch mit einer signifikant verringerten Konzentration zirkulierender endothelialer Zelladhäsionsmoleküle, die Substrate von ADAM10 und ADAM17 sind. Da sich die Proteinexpression der Proteasen nicht veränderte, kann spekuliert werden, dass eine reduzierte Aktivität hierfür verantwortlich ist. Im Ergebnis zeigen diese Daten, dass Fischöl aus der Nahrung die proteolytische Aktivität von ADAM10 und ADAM17 in vivo beeinflussen kann. Eine reduzierte Prozessierung endothelialer Zelladhäsionsproteine könnte die Barrierefunktion des Endothels verbessern und so zu einer verminderten Lipoproteininsudation und Makrophagen-akkumulation in der Intima führen, was letztlich der Atherogenese entgegen wirkt. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde eine mögliche ernährungsspezifische Regulation von ADAMs durch Isothiocyanate untersucht. Diese sekundären Pflanzenstoffe sind in vielen Kreuzblütlergewächsen wie Senf oder Brokkoli zu finden und Gegenstand der Forschung aufgrund ihrer potenziellen antioxidativen, antiinflammatorischen und antikanzerogenen Eigenschaften. Die hier gewonnenen Daten lassen vermuten, dass Isothiocyanate in der Lage sind, die Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 in einer epidermalen Keratinozyten-Zelllinie zu stimulieren. Der Einsatz verschiedener Inhibitoren, ließ den Schluss zu, dass dies auf eine Metalloprotease-abhängige Aktivierung des epidermal growth factor receptor EGFR zurückzuführen ist. Letztlich scheiterten weitere Versuche diesen Mechanismus zu reproduzieren und im Detail zu untersuchen. Es konnte daher nicht abschließend geklärt werden, inwiefern Isothiocyanate die Aktivität von ADAMs in diesem Zellsystem modulieren können. Neben der Ernährung ist die Beeinflussung der ADAMs durch zahlreiche weitere Umweltfaktoren denkbar. Im dritten Teil der Arbeit wurde daher untersucht, ob eine hypoxische Umgebung der Zellen die Proteasen beeinflusst. Eine verminderte Sauerstoffverfügbarkeit tritt beispielsweise sehr häufig in Tumoren und Entzündungsherden auf und eine erhöhte Expression von ADAM17 wird mit diversen Tumorarten assoziiert. Das Mikro-Milieu neoplastischer Zellen ist für die Tumorgenese von entscheidender Bedeutung, da es Eigenschaften wie Proliferation, Invasivität und die Metastasierung enorm beeinflussen kann. Es konnte hier gezeigt werden, dass eine 48-stündige Langzeitstimulation der epithelialen Karzinoma-Zelllinie HEp-2 mit Interferon γ zu einer erhöhten mRNA-Expression von ADAM17 führte, was mit einer erhöhten Prozessierung des Substrates TNFR1 korrelierte. Eine Kultivierung der Zellen unter Hypoxie verhinderte diese Stimulation jedoch. Die molekularen Mechanismen dieser differentiellen Regulation von ADAM17 konnten im Rahmen dieser Arbeit zwar nicht geklärt werden, die hier gewonnenen Erkenntnisse weisen dennoch darauf hin, dass die Sauerstoffverfügbarkeit bei Experimenten, die sich mit der Regulation von ADAM17 in Tumoren beschäftigen, eine größere Beachtung finden sollte. Zusammenfassend lieferte diese Arbeit neue Erkenntnisse zur Regulation der Aktivität von ADAM10 und ADAM17 durch verschiedene Umweltfaktoren. Ein besseres Verständnis der Regulationsmechanismen könnte zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für ADAM-assoziierte Krankheiten wie kardiovaskulären Erkrankungen, Entzündungen und verschiedenen Tumorarten beitragen. Zusätzlich zu pharmazeutischen Interventionen, könnte dies beispielsweise auch eine Änderung von Lebensgewohnheiten wie der Ernährung umfassen.

The metalloproteases ADAM10 and ADAM17 are responsible for the proteolysis of a number of cell adhesion molecules, growth factors, cytokines and even their receptors. Such molecules play important roles in physiological and pathological processes. The regulation of ADAM proteases is therefore of major importance for many research groups. In this respect, the influence of environmental factors on several cellular processes has become an emerging field of interest due to the potential impact of these factors on the development of for example inflammatory diseases. However, so far little is known about a potential regulation of ADAM10 and ADAM17 by environmental factors. Therefore, the main part of this thesis deals with the question whether dietary fatty acids might regulate ADAM10 and ADAM17 in an atherosclerosis mouse model (low density lipoprotein receptor knockout, LDLR-/-). An important role for both proteases in this disease can be estimated, since a number of inflammatory mediators and cell adhesion molecules, who are involved in atherogenesis, are actual substrates for ADAM10 and -17. It has already been shown that polyunsaturated omega-3 fatty acids of fish oil exert protective effects in atherosclerosis. This could be confirmed in the present work. In this study, wild-type and LDLR-/- mice were fed a high fat diet supplemented with either lard (rich in saturated fatty acids) or fish oil. The fish oil-supplemented diet led to less atherosclerotic lesion development in the aorta of LDLR-/- animals than the lard-rich diet. This anti-atherogenic effect of fish oil was not due to a reduction of systemic inflammation, since the plasma concentrations of several classical inflammatory molecules were not reduced. In contrast, the reduction of atherosclerotic lesions in fish oil-fed animals correlated with a significant reduction of a couple of circulating endothelial cell adhesion molecules that are substrates for ADAM10 and ADAM17. This was not accompanied by changes in the protein expression of the proteases, suggesting that this can be rather ascribed to a reduced proteolytic activity. Taken together, evidence is provided here, that fish oil exerted an anti-atherogenic effect in LDLR-/- mice which was accompanied by a reduced release of ADAM17 and ADAM10 substrates from endothelial cells. It is suggested that fish oil-decreased ADAM activity contributes to improved endothelial barrier function and thus counteracts intimal lipoprotein insudation and macrophage accumulation. A second part of this thesis dealt with another possible dietary regulation of ADAMs by isothiocyanates. These secondary plant metabolites are present in cruciferious vegetables such as mustard and broccoli and are of particular interest thanks to their antioxidative, anti-inflammatory and anti-cancerous properties. Results obtained here indicate, that isothiocyanates are able to stimulate the phosphorylation of the MAP-kinases ERK1/2 in an epidermal keratinocyte cell line. The use of different inhibitors suggested, that this is due to a metalloprotease-mediated activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). However, other experiments failed to reproduce these data and analyse the mechanisms in detail. In this respect, it cannot be concluded with certainty if isothiocyanates regulate the activity of ADAMs. Apart from nutrition, it is possible that ADAMs can be influenced by a number of other environmental factors. Hence, a third part of this work analysed whether a hypoxic environment has an impact on ADAM10 or ADAM17 activity. Reduced oxygen availability is present in many cancers and at sites of inflammation and ADAM17 is associated with several types of cancer. The micro-environment of neoplastic cells is of uppermost importance for tumorigenesis, since it can greatly influence processes such as proliferation, invasiveness and metastasis. In this work, a long-term (48 hrs) stimulation of the epithelial carcinoma cell line HEp-2 with interferon γ led to an increased mRNA expression of ADAM17, which correlated with an increase in the processing of tumor necrosis factor α receptor 1. Surprisingly, incubation of the cells in a hypoxic environment completely abrogated this stimulation. While the molecular mechanisms underlying this effect could not be addressed in this work, it nevertheless points out, that the oxygen availability has to be carefully taken into account in experiments that analyse the regulation of ADAM17 in cancer tissue. Taken together, the results of this thesis provide new insights into the regulation of ADAM activity by several environmental factors. A detailed understanding of the regulatory mechanisms could possibly contribute to the development of new therapeutic strategies for ADAM-associated diseases such as cardiovascular diseases, inflammation or certain types of cancer. Apart from pharmaceutical intervention, one such strategy could be a change in lifestyle like nutrition.

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Speck, Nancy: Einfluss von Umweltfaktoren auf die Regulation der Metalloproteasen ADAM10 und ADAM17. 2015.

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