Entwicklung eines in-vitro-Knochenmodells zur Charakterisierung wirkstoffhaltiger Implantate

Rau, Gereon Johannes

Knochen- und Gelenkerkrankungen indizieren in einer alternden Bevölkerung vermehrt operative Eingriffe, bei denen Implantate eingesetzt werden. In Deutschland stieg allein die Zahl der implantierten Hüft- und Knie-Endoprothesen von 344 425 im Jahr 2005 auf 400 806 im Jahr 2011 (DRG-dokumentierte Fälle). Auch wenn die Zahl der postoperativen Komplikationen durch verbesserte Implantate und Operations¬verfahren verringert werden konnte, stellen vor allem Infektion und Lockerung schwerwiegende Probleme dar. Ein innovativer Ansatz zur Prophylaxe dieser Komplikationen ist der Einsatz wirkstoffbeschichteter Implantate. Ziel dieser Arbeit ist es, ein neuartiges in vitro Knochenmodell zu entwickeln mit dem sich die Wirkstofffreisetzung der Implantate und die Wirkstoffverteilung im Knochen standardisiert, kosten- und zeiteffektiv simulieren lässt. Um der hochvariablen Struktur des Knochens und der Vielfältigkeit der Implantate Rechnung zu tragen, wurde ein modulares Design entwickelt, mit dem sich simultan die Hartsubstanz, die lipophilen und hydrophilen Bestandteile und die Perfusion des Knochens modellhaft abbilden lassen. So wird der künstliche Knochen aus einzelnen biplanen Scheiben, den Scaffolds zusammengesetzt. Die Scaffolds bestehen aus gesintertem Hydroxylapatitpulver und weisen eine mikroporöse Struktur auf, die mit wässrigem Medium gesättigt wird. In die mikroporöse Struktur ist ein dreidimen¬sionales Kanalsystem gefräst, das mit lipophilem Medium gefüllt wird. Zur Simulation des Blutflusses wird der künstliche Knochen über zusätzliche vertikale Kanäle mit Freisetzungsmedium perfundiert. Da die gesinterte Hydroxylapatit¬struktur impermeabel ist, kann der Wirkstoff im wässrigen Verteilungsraum nur durch die mediumgefüllten Poren diffundieren. Die Diffusion des Wirkstoffes hängt somit nicht nur von seinem Diffusionskoeffizienten im wässrigen Medium ab, sondern auch von dem Hohlraumvolumen und der Tortuosität des Porensystems (effektiver Diffusionskoeffizient). Somit kann der effektive Diffusionskoeffizient eines Wirk¬stoffes durch die Modifikation der mikroporösen Struktur variiert und an den Diffusionskoeffizienten im biologischen Knochen angeglichen werden. Die Diffusion des Wirkstoffes im lipophilen Verteilungsraum wird durch die Geometrie des dreidimensionalen Kanalsystems und die physikochemischen Eigenschaften des eingebrachten Lipids beeinflusst. Das verwendete Lipid orientiert sich daher idealerweise an der Zusammensetzung des Fettmarks des biologischen Knochens. Die Elimination des Wirkstoffes aus dem künstlichen Knochen kann über die Flussrate des Freisetzungsmediums und die Gesamtoberfläche der Perfusionskanäle variiert werden. Um die zusammengesetzten Scaffolds während des Freisetzungsversuches temperieren und mit Freisetzungsmedium perfundieren zu können, wurden sie in eine eigens entwickelte Durchflusszelle eingebracht. Auch die Durchflusszelle ist modular aufgebaut, sodass sie individuell an den künstlichen Knochen und die Geometrie des zu testenden Implantates angepasst werden kann. Sie ermöglicht die freie Variabilität von Temperatur und Perfusion. Für die Herstellung der Scaffolds wurde ein fünfstufiger Prozess erarbeitet. Da Hydroxylapatit nur gering plastisch verformbar ist und sich nicht direkt zu mechanisch stabilen biplanen Grünlingen verpressen lässt, wurde zunächst Hydroxyl¬apatitpulver mit Polyvinylalkohol als temporärem Bindemittel über Sprühtrocknung in ein Granulat überführt. Eine Bindemittelkonzentration von 2% Polyvinylalkohol erwies sich am geeignetsten, um ein Granulat mit guter Fließfähigkeit herzustellen, das sich im zweiten Prozessschritt zu Grünlingen (Ø 33,0 mm) mit hoher mechanischer Festigkeit verpressen ließ. Im dritten Schritt wurden die Grünlinge zu mikroporösen, biokeramischen Rohlingen gesintert, um das Gefüge dauerhaft zu festigen. Nachfolgend wurden die Scaffolds manuell plan geschliffen, um einen etwaigen, durch den Sinterprozess bedingten Verzug zu beheben. Zur Untersuchung des Einflusses der Grünlingherstellung und des Sinterprozesses auf die Porosität der Rohlinge wurde für die signifikanten Einfluss-größen Presskraft, Sintertemperatur und Heizrate ein zentral zusammengesetzter Versuchsplan erstellt. Auf Grundlage der zuvor gemessenen Effekte der Einflussgrößen konnte ein mathematisches Modell abgeleitet werden, mit dem sich die Prozessparameter für eine vom Anwender vorgegebene Soll-Porosität adäquat vorhersagen lassen. Im letzten Prozessschritt erfolgte die zerspanende Strukturierung der mikroporösen Scaffolds. Durch die Einbindung einer CNC-Fräse konnte die Struktur der Scaffolds hochvariabel programmiert und präzise, reproduzierbar und teilauto¬matisiert gefertigt werden. Zur Aufnahme des zu testenden Implantates wurde mittig in die Scaffolds eine der Geometrie des Implantates entsprechende Kavität ausgefräst. Außerdem wurden die vertikalen Perfusionskanäle und das Kanalsystem zur Aufnahme des Lipids eingefräst. Die Geometrie des Kanalsystems wurde in Abhängigkeit des Soll Verhältnisses von wässrigem zu lipophilem Verteilungsraum programmiert. Zur Validierung des hier entwickelten in-vitro-Knochenmodells wurden beschichtete Modellimplantate hergestellt. Methylenblau wurde als hydrophiler Modellarzneistoff verwendet. Zur systematischen Untersuchung der Effekte der Einflussgrößen Porosität, Flussrate und Freisetzungsdauer wurde ein vollfaktorieller Versuchs¬plan mit 20 Einzelversuchen erstellt. Dazu wurde jeweils ein beschichtetes Implantat in einen aus 12 Scaffolds zusammengesetzten Knochen eingebracht und dieser in die Durchflusszelle eingesetzt. Bei einigen Freisetzungsversuchen zeigte sich ein Übertritt des Methylenblaus in einen Spaltraum zwischen den Scaffolds, der durch einen nicht vollflächigen Kontakt der Scaffolds untereinander bedingt war. Zur Behebung dieses sporadischen Fehlers bei zukünftigen Versuchen ist das manuelle Planschleifen durch ein präzises automatisiertes Verfahren (Läppen) zu ersetzen. Insgesamt zeigten die Freisetzungsversuche erwartungsgemäß eine zeitabhängige Verteilung des Methylen¬blaus im wässrigen Verteilungsraum und eine Elimination über die Perfusionskanäle. Grundlegend konnte nachgewiesen werden, dass die Porosität einen signifikanten Einfluss auf die Diffusion des Methylenblaus hatte. Durch den modularen Aufbau des künstlichen Knochens und der Durchflusszelle kann das in-vitro-Knochenmodell durch den Anwender individuell an das zu testende Implantat und die Knochenstruktur am Applikationsort angepasst werden. Dem Anwender steht somit ein neuartiges Analyseverfahren zur Verfügung, mit dem er beschichtete Implantate standardisiert und kosteneffektiv prüfen kann.

In an aging population bone and joint diseases indicate an increasing number of surgical interventions associated with implantation. From 2005 to 2011 only the number of hip and knee replacement surgeries increased from 344 425 to 400 806 in Germany (DRG-documented cases). Although, postoperative complications could be reduced by improved implants and surgical methods, especially infection and loosening are still fatal problems. The use of drug coated implants is an innovative approach, to overcome these complications prophylactically. The aim of this work is to develop a novel in-vitro bone model, with which the drug release of implants and the drug distribution within the bone can be standardised, cost- and time-effectively simulated. With respect to the high structural variability of bone and the diversity of implants, a modular design was developed, which allows an exemplary depiction of the bone tissues, the hydrophilic and lipophilic components and the perfusion of bone simultaneously. Thus, this artificial bone is assembled of biplane discs, the so called scaffolds. The scaffolds consist of sintered hydroxyapatite powder. They have a microporous structure, which will be saturated with an aqueous medium. A three dimensional channel system is milled into the microporous structure, which will be filled with lipophilic medium. The artificial bone is perfused with dissolution medium over additional vertical channels, in order to simulate the perfusion of bone. Since the hydroxyapatite structure is impermeable, diffusion of the drug within the aqueous compartment takes place only through the medium-filled pores. Thus, the drug diffusion is based on the drug’s diffusion coefficient in the media solely, as well as on the void fraction and the tortuosity of the porous system (effective diffusion coefficient). By modifying the microporous structure the effective diffusion coefficient of a drug can be adjusted to its diffusion coefficient within biological bone. The diffusion of the drug within the lipophilic compartment is affected by the structure of the channel system and the physicochemical properties of the used lipid. Thus, the used lipid should ideally match the composition of the fatty bone marrow. The elimination of the drug can be controlled by the dissolution medium flow rate and the total surface area of the perfusion channels. A novel flow cell was specially designed and built, in order to enable perfusion and tempering of the artificial bone, whereas temperature and perfusion are variable. The flow cell has also a modular design, so that it can be individually adjusted to the biological bone and the implant geometry. For the manufacturing of the scaffolds, a five-stage process was developed. Since hydroxyapatite is brittle, it cannot directly be compacted to mechanical stable greens. Thus, hydroxyapatite powder was initially granulated with polyvinyl alcohol as temporary binder via spray drying. A binder concentration of 2% polyvinyl alcohol was most suitable for a granulate with adequate flow properties, which in the second process stage could be compacted to greens (Ø 33,0 mm) with a high mechanical stability. In the third stage, greens were sintered to microporous, bioceramic blanks to solidate their structure. Afterwards, the scaffolds were manually sanded to remedy any sintering-induced warpage. Design of experiment was used to determine the influence of the green manufacturing process and the sinter process on the microporosity of the blanks. A central composite design was designed for the significant variables pressing force, sintering temperature and heating rate. Based on the measured effects a mathematical model could be derived, which allowed an adequate prediction of the required process parameter for a target-porosity, demanded by the user. The patterning of the microporous scaffolds was conducted in the last process stage. By implementing a CNC-router, the structure of the scaffolds could be highly variable programmed and precisely, reproducible and partially automated manufactured. To be able to insert the implant into the artificial bone, a cavity was milled into the centre of the scaffolds considering the geometry of the implant. Furthermore, the vertical perfusion channels and the channel system for the lipid uptake were milled into the scaffolds. The geometry of the channel system was programmed with regard to the target-ratio of aqueous to lipophilic compartment. In order to validate the developed in-vitro bone model model implants were coated with methylenblue as hydrophilic model drug. A full factorial design with 20 tests were performed in order to determine their effect of the variables porosity, perfusion rate and dissolution time. For each test a coated model implant was inserted into an artificial bone, consisting of 12 scaffolds, which was subsequently transferred into the flow cell. In some tests methylenblue penetrated into a gap between scaffolds, which resulted from an incomplete contact of the involved scaffolds among themselves. For the rectification of this infrequent defect, the manual sanding has to be replaced by a precise automated process (lapping). Taken as whole, the dissolution tests showed a time-dependent distribution of methylenblue in the aqueous compartment and its elimination over the perfusion channels, as expected. It could be principally shown, that the variable porosity had a significant influence on the diffusion of methylenblue. Due to the modular design of the artificial bone and the flow cell the user can individually adjust the in-vitro bone model to the implant to be tested and the bone structure at the application site. Hence, an innovative analysis method is available, which allows the user a standardised and cost-effective characterisation drug-coated implants.

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Rau, Gereon Johannes: Entwicklung eines in-vitro-Knochenmodells zur Charakterisierung wirkstoffhaltiger Implantate.

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