Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der Proteolyse des Kv7.1

Strigli, Anne

In Vorarbeiten zu dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der spannungsabhängige Kaliumkanal Kv7.1 zu zwei carboxyterminalen Fragmenten (CTF1 und CTF2) prozessiert wird. Das kleinere CTF2 des Kv7.1 entsteht dabei durch Caspasen-vermittelte Proteolyse nach dem Aspartatrest 459. Bisher konnte noch nicht geklärt werden, an welcher Position in Kv7.1 das größere CTF1 entsteht. In dieser Arbeit sollte analysiert werden, welche Caspasen den Kanal unter welchen (patho-) physiologischen Bedingungen schneiden. Außerdem sollte die Bildung des CTF1 sowie die Auswirkungen der Proteolyse auf die Kanalfunktion von Kv7.1 untersucht werden. Zunächst ergaben Mutationsstudien, dass der Schnitt zum CTF1 an einem GSGF-Motiv kurz nach der sechsten Transmembrandomäne des Kv7.1 stattfindet. Stromkurven-Analysen von Kv7.1-Mutanten mit veränderter CTF1-Prozessierung in Froscheizellen konnten beweisen, dass die Proteolyse zum CTF1 die Kanalaktivität von Kv7.1 beendet. Zusätzlich wurde untersucht, wie die proteolytische Prozessierung zum CTF2 die Kanalfunktion des Kv7.1 beeinflussen kann. Mittels Ko-Immunopräzipitationsstudien wurde festgestellt, dass der Kv7.1 nach der limitierten Proteolyse zum CTF2 kein Calmodulin mehr bindet. Somit hebt auch die Spaltung zum CTF2 den Kv7.1-vermittelten zellulären Kaliumefflux auf. [...]

Previous studies indicated that the voltage-dependent potassium channel Kv7.1 undergoes proteolysis, generating two C-terminal fragments (CTF1 and CTF2). While the smaller CTF2 fragment is generated by caspases requiring an aspartate at position 459, the cleavage position for the origination of the bigger CTF1 remained unknown. Thus, this thesis aimed to elucidate which caspases are responsible for Kv7.1 cleavage. Additionally, the functional impact of the fragmentation under different (patho-) physiological conditions as well as the consequence of proteolysis on the channel function of Kv7.1 was analyzed. The cleavage site of the CTF1 fragment at a GSGF-motif near the sixth transmembrane domain of Kv7.1 was described using site-directed mutagenesis. The analysis of the electrophysiology of Kv7.1 mutants with altered processing to the CTF1 in Xenopus laevis oocytes revealed that the channel function of Kv7.1 is lost after fragmentation to the CTF1. Additionally, it was analyzed how the caspase-dependent processing of Kv7.1 can interfere with the Kv7.1-mediated potassium flux. Co-immunoprecipitations studies showed that Kv7.1 cannot bind calmodulin after limited proteolysis. Therefore, a proteolytically processed Kv7.1 remains inactive. [...]

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Strigli, Anne: Untersuchungen zur funktionellen Bedeutung der Proteolyse des Kv7.1. 2015.

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