Aciclovir resistance phenotype of clinical isolates proven by targeted mutagenesis of recombinant herpes simplex and varicella zoster viruses

Brunnemann, Anne-Kathrin

The members of the human pathogenic α-herpesviruses herpes simplex virus (HSV) type 1 and 2 as well as varicella zoster virus (VZV) establish persistent infections of sensory ganglia and cause recurrent vesicular rashes. Especially immunocompromised patients suffer often from severe infections and need prolonged antiviral therapy at high dosage resulting in the emergence of resistance that is associated with sequence alterations of the affected viral enzymes. The nucleoside analog aciclovir (ACV) is the first line drug in such cases. Extended therapy often results in multiple amino-acid exchanges in the ACV-converting viral thymidine kinase (TK) of HSV. This multiplicity of polymorphisms and the difficulty of isolating clinical VZV hamper the precise assignment of the responsible nucleotide mutation to its resistance phenotype. Here, the impact on ACV resistance of clinically relevant amino-acid mutations in the viral TK was assessed by the generation of virus recombinants that harbor one single TK mutation in an otherwise wild-type background. For this purpose, the genomes of HSV-1, HSV-2, and VZV which were cloned as bacterial artificial chromosome (BAC) were used for traceless sequence modifications by en passant mutagenesis in bacteria. First, a fluorescence reporter gene was inserted into a suitable genome position to monitor viral replication and to facilitate subsequent susceptibility testing. Based on the fluorescence-labeled and the basic BACs, the native TK-encoding genes were deleted and substituted with genes that harbored one single desired mutation. After virus reconstitution in permissive eukaryotic cells, the fluorescent virus strains exhibited replication capacities similar to their non-fluorescent counterparts and to the recombinant parental virus with wild-type configuration. Intact TK expression was demonstrated by detection of TK-specific transcripts and proteins. Furthermore, the correlation between the relative fluorescence intensity [...].

Die Vertreter der humanpathogenen α-Herpesviren Herpes-Simplex-Virus (HSV) 1 und 2 sowie das Varicella-Zoster-Virus (VZV) etablieren persistente Infektionen sensorischer Ganglien und verursachen wiederkehrende, vesikuläre Exantheme. Besonders immungeschwächte Patienten leiden oft unter schwerwiegenden Infektionen und benötigen eine hoch dosierte und andauernde antivirale Therapie, die zur Entstehung von Resistenzen führt, die mit Sequenzveränderungen der betroffenen viralen Enzyme einhergehen. Das Nukleosid-Analogon Aciclovir (ACV) ist das Mittel der ersten Wahl bei solchen Fällen. Die andauernde Behandlung führt oft zu mehrfachen Aminosäure-Austauschen in der ACV-umsetzenden viralen Thymidinkinase (TK) von HSV. Diese Mehrzahl von Polymorphismen und die Schwierigkeit, VZV aus klinischen Proben zu isolieren, erschweren die eindeutige Zuordnung der verantwortlichen Nukleotid-Mutationen zu ihrem Resistenz-Phänotyp. Hier wurde die Auswirkung der klinisch relevanten Aminosäure-Mutationen in der viralen TK auf ACV-Resistenz beurteilt, indem rekombinante Virusstämme hergestellt wurden, die eine einzige TK-Mutation in einem ansonsten Wildtyp-Hintergrund aufweisen. Zu diesem Zweck wurden die als bakterielles artifizielles Chromosom (BAC) klonierten Genome von HSV-1, HSV-2 und VZV für die spurlose Sequenzmodifikation durch die en passant Mutagenese in Bakterien verwendet. Zuerst wurde ein Fluoreszenz-Reporter-Gen in eine geeignete Genomposition eingebracht, so dass die Virusreplikation beobachtet und die folgende Empfindlichkeits-Testung erleichtert wurde. Ausgehend von den Fluoreszenz-markierten und den originalen BACs wurden die ursprünglichen TK-kodierenden Gene entfernt und gegen Gene ausgetauscht, welche eine einzige gewünschte Mutation enthielten. Nach der Virus-Rekonstitution in permissiven, eukaryonten Zellen zeigten die Fluorenzenz-markierten Virusstämme ein ähnliches Replikationsvermögen wie ihr nicht-fluoreszierendes Gegenstück und wie das rekombinante [...].

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Brunnemann, Anne-Kathrin: Aciclovir resistance phenotype of clinical isolates proven by targeted mutagenesis of recombinant herpes simplex and varicella zoster viruses.

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