Expressionssysteme zur Gewinnung von rekombinantem PfFNT zur Reinigung, Funktionsuntersuchung und Kristallisation

Holm-Bertelsen, Julia

PfFNT, ein Laktat-Transporter aus dem Malaria-Erreger P. falciparum, ist aufgrund seiner Rolle im Energiestoffwechsel des Parasiten ein valides Target für die Therapie der Malaria. Ziel dieser Arbeit war es, große Mengen gereinigtes, homogenes und korrekt gefaltetes Protein zu gewinnen, um die später resultierende Kristallstruktur für ein rationales Inhibitordesign nutzen zu können. Die Eignung verschiedener Expressionssysteme sollte für diesen Zweck geprüft werden. Es konnte gezeigt werden, dass PfFNT sowohl in E. coli, P. pastoris und im zellfreien System hergestellt wurde. Mit einer Ausbeute von mehreren Milligramm Protein pro Milliliter über Nacht, schien die zellfreie Proteinherstellung ein idealer Ausgangspunkt für weitere Reinigungen zu sein. Transportassays nach Rekonstitution in Liposomen verstärkten diesen Eindruck, da diese die Funktionalität und somit korrekte Faltung des PfFNTs zeigen konnten. Des Weiteren konnte ein Faktor Xa Verdau zeigen, dass ein gerichteter Einbau in die Liposomen erfolgte. Diese Entdeckung ermöglichte erstmalig die Messung der physiologischen Transportrichtung. Trotz dieser Ergebnisse konnten die Elutionsprofile der Gelfiltration nur eine Mischung verschiedener oligomerer Formen zeigen, deren einzelne Oligomere schwer zu isolieren waren. Es konnten allerdings verschiedene oligomere Formen in einer zweiten Reinigung isoliert und für Kristallisationsversuche eingesetzt werden. Ein Proteinkristall konnte in keinem der Versuche gewonnen werden. In E. coli Zellen konnte ebenfalls PfFNT exprimiert werden, die Ausbeuten waren allerdings gering und fielen vornehmlich als inclusion bodies an. Die weitere Verwendung wurde daher nicht weiter in Erwägung gezogen. Aus P. pastoris Zellen konnten nach der erfolgreichen Fermentierung mehrere Milligramm PfFNT aus den Membranen solubilisiert werden. Obwohl das Pentamer sich als sehr stabil erwiesen hatte, wurde auch bei dieser Reinigung wieder eine Mischung verschiedener Oligomere gefunden.

PfFNT, a lactate transporter of P. falciparum, is due to its role in the energy metabolism a valid drug target for the therapy of malaria. The aim of this work was to receive large amounts of pure, homogenous and correctly folded protein to start crystallization trials, to use this structure in the future for a rational drug design. The suitability of different expression systems should be evaluated for this purpose. It could be shown, that PfFNT was expressed in E. coli, P. pastoris and an E. coli based cell-free system. With milligram yields of protein per milliliter overnight, the cell-free expression appeared to be an ideal starting point for further purification steps. Transport assays after reconstitution in liposomes strengthened this result, as they revealed functionality in light scattering measurements and therefore native folding of the PfFNT. Furthermore, a factor Xa digest indicated an even orientation in the liposome bilayer. This discovery led, for the first time, to measurements of the physiological transport direction. However, the elution profiles of size exclusion chromatography revealed a mixture of oligomeric forms, with oligomers hard to isolate, and could not be optimized using several buffer conditions and Fos-Choline instead of Brij78. For this reason crystallization trials were set up with different oligomeric forms which could be extracted in a second run. Crystallization has not yet been successful. In E. coli, PfFNT could be expressed in very small amounts and mainly as inclusion bodies. It was therefore not taken into consideration for crystallization. After a successful growth in a bioreactor several milligrams PfFNT could be solubilized with DDM, DM, LDAO and Fos-Cholin 12 of P. pastoris cells. Although the pentamer seemed to be very stable, a mixture of different oligomeric states was found again on a gelfiltration column.

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Holm-Bertelsen, Julia: Expressionssysteme zur Gewinnung von rekombinantem PfFNT zur Reinigung, Funktionsuntersuchung und Kristallisation. 2016.

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