Untersuchung von SNARE-Proteinen als mögliche Interaktionspartner des lysosomalen integralen Membranproteins Typ 2 (Limp-2)

Knabbe, Ernst Ulrich Johannes

Limp-2 ist das Transportmolekül für die lysosomale Hydrolase β-Glucocerebrosidase vom endoplasmatischen Retikulum in das Lysosom. Mutationen in Limp-2 führen beim Menschen zum action myoclonus renal failure Syndrom (AMRF), das eine myoklonische Epilepsie mit progressivem Nierenversagen beinhaltet. Der Knockout von Limp-2 in der Maus erzeugt bei betroffenen Tieren unter anderem eine Hypernephrose aufgrund urethraler Konstriktion, für die fehlerhafte endocytotische Recycling-Prozesse und gestörte endosomal-lysosomale Fusionsprozesse verantwortlich gemacht werden. Überexpression von Limp2-Konstrukten in verschiedenen Zelllinien führt zur Bildung stark vergrößerter endosomal-lysosomaler Strukturen. In vorherigen Arbeiten wurde ein Screen zur Identifikation neuer möglicher Interaktionspartner durchgeführt und das im endoplasmatischen Retikulum lokalisierte SNARE-Protein D12/Use1 ausgewählt. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels des Yeast-Two-Hybrid-Systems die Interaktion bestätigt werden. Immunpräzipitationen sowohl von D12 als auch von Limp-2 zeigten ebenfalls die Interaktion. Des Weiteren wurde das Motiv in D12 identifiziert, das die Interaktion vermittelt. Außerdem wurde das endoplasmatische Retikulum als Ort der beobachteten Interaktion nachgewiesen. Ferner konnte in einer Lysosomenpräparation aus Mäusen gezeigt werden, dass D12 nicht nur im ER, sondern auch lysosomal vorkommt. Es ergaben sich keine Unterschiede in der Verteilung beziehungsweise Lokalisation von D12 in Limp-2-Knockout- oder Wildtyp-Tieren, bis auf die Akkumulation eines möglichen Spaltfragmentes von D12 in den Lysosomen von Limp-2-Knockout-Mäusen. Genauso wenig fanden sich eindeutige Hinweise auf Beeinflussung der Oberflächenlokalisation oder des ER-Exits von Limp-2 durch D12. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass starke Hinweise auf eine Interaktion und die zugehörige Domäne in D12 gefunden wurden, die Bedeutung der Interaktion für die Zelle nicht geklärt ist.

Limp-2 transports the lysosomal hydrolase -Glucocerebrosidase from the endoplasmic reticulum to the lysosome. Mutations in Limp-2 lead to action myoclonus renal failure syndrome (AMRF) in humans. Knockout of Limp-2 in mice results in hypernephrosis caused by ureteric pelvic junction obstruction due to impaired endocytic recycling processes and endosomal-lysosomal fusion. Overexpression of Limp-2 constructs in cell lines causes the formation of enlarged endosomal-lysosomal structures. In previous work a screen for the identification of new interaction partners of Limp-2 was performed and the SNARE D12/Use1, which is localized in the ER, was chosen for further investigation. In this thesis the Yeast-Two-Hybrid System was used to confirm the interaction. Immunprecipitations of D12 and Limp-2 demonstrated the interaction as well. Furthermore a short motif in D12 was shown to mediate the interaction between the two proteins. The ER was identified as the possible location for the interaction in the cell. In preparations from mice, a lysosomal localization of D12 could be demonstrated. Colocalization of D12 and Limp-2 in the enlarged compartments that form after Limp-2 overexpression argues for a role of the interaction in this process. There were no differences between the localization of D12 in Limp-2-Knockout or Wildtype animals, except for the accumulation of a possible fragment of D12 in the Limp-2-Knockout mice. There were no distinct hints that D12 influences the surface localization or the ER-exit of Limp-2. In summary the proposed interaction between D12 and Limp-2 was demonstrated and the motif in D12 responsible for the interaction was shown.

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Knabbe, Ernst Ulrich Johannes: Untersuchung von SNARE-Proteinen als mögliche Interaktionspartner des lysosomalen integralen Membranproteins Typ 2 (Limp-2).

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