Identifikation und Lokalisation der seneszenzassoziierten Cysteinprotease HvPAP14 in Gerste

Hollmann, Julien-Alexander

Während der Blattseneszenz werden die Proteine des Photosyntheseapparates in den Chloroplasten abgebaut und der enthaltene Stickstoff remobilisiert. Um Proteasen zu identifizieren, die entscheidend am Proteinabbau während der Seneszenz von Gerstenblättern beteiligt sind, wurden zwei Ansätze verfolgt. Zum einen wurde die Genexpression während der Seneszenz an Fahnenblättern der Gerste unter Freilandbedingungen untersucht. Zum anderen wurde ein biochemischer Ansatz zur Identifizierung aktiver Cysteinproteasen in seneszierenden Primärblättern der Gerste durchgeführt. Die Genexpressionsuntersuchungen erfolgten mit Blattmaterial der Hochleistungssorte cv. Lomerit. Durch eine Microarray-Analyse wurden Gene identifiziert, die während der Seneszenz in Blättern der Sorte Lomerit verstärkt exprimiert werden. Zur Unterscheidung von Genen, die entweder eine Rolle in der Stickstoffremobilisierung oder in entwicklungsabhängigen Prozessen spielen, wurde die Genexpression in unterschiedlich stark mit Stickstoff gedüngten Pflanzen verglichen. Das entwicklungsabhängig verstärkt exprimierte Gen HvPAP14 war unabhängig von der Düngung eines der am stärksten während der Seneszenz aufregulierten Gene. Mittels einer Affinitätsaufreinigung über DCG-04 und anschließender Massenspektrometrie wurde HvPAP14 unter den während der Blattseneszenz proteolytisch aktiven Cysteinproteasen identifiziert. Mit Hilfe von zwei Antikörpern gegen unterschiedliche Bereiche von HvPAP14 konnte eine Proform in Microbodies und in Chloroplasten nachgewiesen werden. In den Chloroplasten wurde die Proform sowohl in der Thylakoidmembranfraktion als auch im Lumen und die potentiell aktive Form nur in der Thylakoidmembranfraktion detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Cysteinprotease HvPAP14 aus dem ER in die Chloroplasten transportiert wird und dort vermutlich am Abbau von Proteinen der Thylakoidmembran beteiligt ist.

During leaf senescence proteins of the photosynthetic apparatus are degraded in chloroplasts and nitrogen is remobilized. To identify proteases involved in protein degradation during barley leaf senescence, two approaches were used. First, gene expression of barley flag leaves grown under field conditions was analysed. Second, a biochemical approach was used to identify active cysteine proteases in senescing primary foliage leaves. For gene expression studies leaves of the high-yield barley variety cv. Lomerit were used. By microarray analyses senescence-associated genes were identified in barley flag leaves collected from field plots with standard or high nitrogen supply. Due to the different amounts of nitrogen supply it was possible to distinguish between genes that play a role in nitrogen remobilization or in development-dependent processes. Independent of the nitrogen supply, HvPAP14 was identified as one of the most up- regulated genes in senescing flag leaves. By an affinity approach based on the probe DCG-04 and subsequent mass spectrometry, HvPAP14 was identified as one of the proteolytic active cysteine proteases during leaf senescence. Using two antibodies against different regions of HvPAP14 the subcellular localisations of these different forms were analysed. The proform was detected in micro- bodies as well as in chloroplasts in association with thylakoid membranes and in the lumen. The potentially proteolytic active form of the enzyme could be detected exclusively in the thylakoid membranes. The results show, that the cysteine protease HvPAP14 is transported from the ER into the chloroplasts and is presumably involved in the degradation of thylakoid membrane proteins.

Zitieren

Zitierform:

Hollmann, Julien-Alexander: Identifikation und Lokalisation der seneszenzassoziierten Cysteinprotease HvPAP14 in Gerste.

Rechte

Nutzung und Vervielfältigung:
Keine CC Lizenz (es gilt das deutsche Urheberrecht)

Export