Dictyostelium-Amöben : Charakterisierung endogener und heterologe Expression humaner Tetraspanine

Scheltz, Tineke

In dieser Arbeit erfolgten die ersten Schritte zum Aufbau einer Plattform, die zukünftig zur Untersuchung von Tetraspanin‑Protein‑Interaktionen dienen soll. Im Menschen bedingen viele Isoformen eine hohe Komplexität, so dass hier die Amöbe D. discoideum eingesetzt wurde. Deren Eignung als Modellorganismus sowie zur Produktion von humanen Tetraspaninen wurde im Rahmen dieser Arbeit untersucht. Zunächst wurden die endogenen Tetraspanine charakterisiert. Expressionsanalysen zeigten, dass von fünf annotierten Tetraspaninen drei, TspA, TspC und TspD, im Amöbenstadium vorkamen. Die Fluoreszenz von Tetraspanin‑GFP‑Fusionsproteinen konnte eine Lokalisation in intrazellulären Strukturen zeigen, die durch eine Co-Färbung mit der Protonenpumpe als System der kontraktilen Vakuolen identifiziert werden konnte. Die Gendeletion des TspC zeigte einen mit der Lokalisation konsistenten Defekt in der Osmoregulation, der vermutlich durch eine fehlerhafte Entladung der Vakuolen zu begründen ist. Basale Zellparameter blieben, ebenso wie nach Deletion von TspD, unverändert. Die Untersuchung weiterer Funktionen, auch im Hinblick auf die Gendeletion von TspA und einer dreifach‑knockout‑Mutante, sowie die Identifizierung von Interaktionspartnern, stellen zentrale Elemente bezüglich einer abschließenden Beurteilung von D. discoideum als Modellorganismus dar. Die Herstellung ausgewählter humaner Tetraspanine als GFP-Fusionsproteine in D. discoideum diente der weiteren Eignungstestung als Plattform. Dabei wurde eine im Hochdurchsatz durchführbare fluoreszenzmikroskopische Quantifizierungsmethode etabliert. Im Vergleich zum endogenen TspA und humanem heterolog hergestellten funktionellem AQP1 erwiesen sich die Herstellungsmengen als gering. Eine Codon-Optimierung des gesamten offenen Leserahmens von CD81 konnte die Herstellung um das 4,5‑fache verbessern, so dass die Herstellungsmengen größer als die des AQP1 waren. Die Anwendbarkeit der Codon-Optimierung auf andere Tetraspanine wird eine abschließende Eignung von D. discoideum zur Proteinproduktion von Tetraspaninen zeigen.

This thesis provides the basis for the development of a platform allowing for the investigation of tetraspanin-protein interactions. The complexity in humans due to multiple tetraspanin-isoforms asks for a simple organism like the amoeba D. discoideum. The suitability of D. discoideum as a modell organism and for heterologous tetraspanin production was evaluated and endogenous tetraspanins were characterized. Expression analysis showed the presence of three out of five isoforms in the amoeba stage (TspA, TspC and TspD). The fluorescence of tetraspanin-GFP fusion proteins showed the localization of the amoeba tetraspanins on intracellular structures, identified as the contractile vacuoles by co-staining of the proton pump. Consistent with the localization, TspC− Dictyostelium cells had a defect in coping with osmotic stress, presumably due to incorrect discharge of the vacuoles. Basal cell parameters were not affected in TspC− and TspD− cells. Further functional testing, regarding the knockout of TspA and a triple knockout mutant, as well as the identification of interacting partner proteins could complete the evaluation of D. discoideum as a model. Heterologeously produced human tetraspanin-GFP fusion proteins could be detected by a newly established high content fluorescence imaging method. Compared to endogenous TspA and human heterologous functional AQP1, the level of production was low. To yield higher amounts, the full open reading frame of CD81 was codon optimized leading to a 4.5 times increase in expression that was even higher than that of AQP1. Applying the codon optimization to other tetraspanins will complete the evaluation of D. discoideum for heterologous production.

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Scheltz, Tineke: Dictyostelium-Amöben : Charakterisierung endogener und heterologe Expression humaner Tetraspanine.

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