Design of a Stabilizing and Switching Module for alpha-Helical Peptides

In this work, the concept of a modular approach to stabilize and switch the structure of α-helical proteins and peptides was investigated. To achieve such, we designed a fusion protein which consists of two parts. The first part, an independent protein module, comprises a highly stable helical fold and the possibility to incorporate a light responsive unit for manipulation of the structure. The second part consists of a peptide sequence with a structure-dependent activity. We used the 20 amino acid long Trp-cage miniprotein as basis for the stabilizing and switching module. Its tertiary structure consists of an eight amino acid long N-terminal α-helix, whose fold is induced by encapsulation of the eponymous tryptophan side chain by several C-terminal residues. This results in a very stable tertiary fold of the module. In order to introduce switchability into the miniprotein, we cross-linked the Trp-cage with a photo responsive linker. In this work, we used N-hydroxysuccinimide esters (NHS) as reactive groups for the cross-linking, which are reactive towards primary amines (lysine residues), and azobenzene as the scaffold for a switchable linker. In the second part of this work, one repeat of the α-helical antifreeze protein AFP "Type 1 HPLC6" was fused with the Trp-cage module using a chimera strategy. In order to combine and correlate the secondary structure of the proteins, the sequences were overlapped, resulting in a chimera protein. This protein comprises at the N-terminus the sequence of the antifreeze protein, followed by a chimera region with a combination of both sequences, and is completed by the C-terminal sequence of the Trp-cage. The junction of the sequences is possible in four different ways altering the orientation of the active side of the antifreeze protein relative to the tertiary structure of the Trp-cage. All four variants were spectroscopically characterized in order to ascertain their structure. Furthermore, the activity of the four chimera proteins was determined by observing the ice crystal growth in presence of the proteins.

In dieser Arbeit wurde ein modulares Konzept zur Stabilisierung und Schaltung der Struktur α-helikaler Proteine und Peptide untersucht. Zur Realisierung dieses Konzeptes haben wir ein Fusionsprotein entwickelt, welches sich aus zwei Teilen zusammensetzt. Der erste Teil besteht aus einem Protein mit einer stabilen helikalen Faltung und der Möglichkeit, eine photoresponsive Einheit zur Manipulation der Struktur einzuführen. Der zweite Teil wird von einer Peptidsequenz mit strukturabhängiger Aktivität gebildet. Das Schaltmodul basiert auf dem 20 Aminosäuren langen Trp-cage Miniprotein, dessen Struktur eine acht Aminosäuren lange N-terminalen α-Helix enthält. Die Faltung wird durch hydrophobe Wechselwirkungen einer Tryptophan–Seitenkette mit mehreren C-terminalen Aminosäuren induziert, was zu einer hoch stabilen, tertiären Faltung führt. Zur Schaltung der Faltung haben wir in diese Struktur ein photoresponsives Molekül eingeführt. In dieser Arbeit wurde N-Hydroxysuccinimid-Ester als reaktive Gruppe und Azobenzol als Grundgerüst verwendet. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine Wiederholungseinheit des α-helikalen Antigefrier- proteins „Type 1 HPLC6“ mit dem Trp-cage in einem Chimären-Konzept fusioniert. Zur Verknüpfung und Korrelation der Sekundärstrukturen beider Proteine wurden ihre Sequenzen überlappt, was zu einem Chimären-Protein führt. Dieses Protein lässt sich in drei Abschnitte einteilen. Die Sequenz des Antigefrierproteins bildet den N-terminalen Abschnitt, der mittlere Abschnitt enthält Sequenzen beider Proteine, während der C-terminale Abschnitt aus der Trp-cage-Sequenz besteht. Nach diesem Prinzip ergeben sich vier Kombinationsmöglichkeiten unter Berücksichtigung der Orientierung der aktiven Seite des Antigefrierproteins und der Tertiärstruktur des Trp-cages. Alle vier Varianten wurden zur Strukturbestimmung spektroskopisch charakterisiert. Darüber hinaus wurde die Aktivität der vier Chimären-Proteine mittels Beobachtung des Eiskristallwachstums in Gegenwart der Proteine bestimmt.



Use and reproduction:

No license. The provisions of the German Copyright Act (UrhG) apply.

Please note that individual components of the publication may be subject to other licensing or copyright conditions.


Citation style:
Could not load citation form.