Klonspezifische IGH-Plasmide als alternativer Standard zur Quantifizierung minimaler Resterkrankung mittels Real-Time PCR beim follikulären Non-Hodgkin Lymphom

Laubenstein, Tobias

Zielsetzung der Arbeit war es, einen auf klonspezifischen IGH-Plasmiden basierenden RQ-PCR-Assay zur MRD-Quantifizierung beim FL zu etablieren, welcher im Falle des Fehlens einer detektierbaren t(14;18)-Translokation verwendet werden kann. Dafür wurde das klonale IGH-Rearrangement von 24 Patienten und einer Zelllinie mittels IGH-PCR amplifiziert, sequenziert und analysiert und folglich die IGH-Plasmid-Standards mittels Klonierung generiert. Für die RQ-PCR wurden patientenspezifische (ASO-) Primer und Konsensus- oder ASO-Sonden zur Amplifikation der CDR3-Region verwendet. Im Rahmen eines Zelllinien-Versuches konnte eine sehr genaue IGH-Quantifizierung anhand der Plasmid-Standards gezeigt werden. Im Rahmen der Evaluation an Materialien von Patienten mit FL (24 Pat., 109 DNA-Proben) zeigten die Plasmid-Standards gegenüber genomischer (IGH-) DNA vergleichbar gute Ergebnisse bezüglich Sensitivität und eine signifikante Überlegenheit in Bezug auf die Steigung der Standardkurve, den Korrelationskoeffizienten und die PCR-Effizienz. Es konnten MRD-Niveaus der Verlaufsproben mit überwiegend hoher Konkordanz vergleichend anhand der IGH-Plasmide, genomischer IGH-DNA-Standards und der RQ-PCR der t(14;18)-Translokation quantifiziert werden. Abschließend wurde an 14 Patienten (41 Primär- und Verlaufsproben) prospektiv die Anwendbarkeit der IGH-Plasmid-Standards zur MRD-Diagnostik bei Fehlen einer PCR-amplifizierbaren t(14;18)-Translokation untersucht. Es konnte dabei in allen Fällen ein IGH-Plasmid-basierter RQ-PCR-Assay mit jeweils sehr guter Sensitivität und Spezifität etabliert werden und somit sämtliche Primär- und Verlaufsmaterialien zuverlässig quantifiziert werden. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit eine RQ-PCR-Strategie zur MRD-Diagnostik beim FL etabliert werden, welche auf der Verwendung klonspezifischer IGH-Plasmid-Standards basiert und eine geeignete Alternative für die MRD-Diagnostik beim t(14;18)-negativen follikulären Non-Hodgkin-Lymphom und anderen klonalen B-Zell-Neoplasien darstellt.

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Laubenstein, Tobias: Klonspezifische IGH-Plasmide als alternativer Standard zur Quantifizierung minimaler Resterkrankung mittels Real-Time PCR beim follikulären Non-Hodgkin Lymphom.

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