Structural Characterization of Flavin-dependent Monooxygenases from Zonocerus variegatus and the Human Mitochondrial Amidoxime Reducing Component (mARC) – Enzymes involved in Biotransformation

Kubitza, Christian ORCID

Organisms are permanently exposed to foreign and harmful substances. These xenobiotics have to undergo metabolic processes in order to be eliminated from the organism. This process is called biotransformation. Therefore, it is of significant importance to increase our knowledge about enzymes involved in biotransformation processes and detoxification pathways, especially about their three-dimensional structures. This cumulative thesis focuses on structure determination of two biotransformation enzymes, the flavin-dependent monooxygenase from Zonocerus variegatus (ZvFMO) and the human mitochondrial amidoxime reducing component (mARC). FMOs are able to oxygenate heteroatom-containing substances, whereas the mARC enzyme system is very effectively reducing a broad range of heteroatom-hydroxylated xenobiotics. Different high-resolution ZvFMO structures provided insight into the coordination of cofactors and related conformational rearrangements of the enzyme. Furthermore, a hitherto unknown dimeric arrangement of subunits was observed for ZvFMO isoforms. To further investigate differences in the catalytic activity of ZvFMOs, a variety of ZvFMOa variants were generated. Thereby, significant impacts on enzyme activity were observed even for single exchanges within the substrate entry site. The elucidated mARC crystal structure was the first MOSC protein that clearly showed the coordination of its molybdenum cofactor and exhibited a topology, which contradicts in silico predictions of structural domains currently used for online databases. The large substrate spectrum could be correlated to a surface-exposed active site. Paralogue-specific amino acid residues were identified, which allow for the secure discrimination between mARC1 and mARC2 enzymes. Moreover, structural features indicate that mARC enzymes represent an evolutionary link between the two molybdoenzyme superfamilies of sulfite oxidases and xanthine oxidases.

Organismen sind ständig verschiedensten körperfremden und oft auch schädlichen Substanzen ausgesetzt. Solche Xenobiotika müssen metabolische Prozesse durchlaufen, um vom Organismus ausgeschieden werden zu können. Dieser Prozess wird als Biotransformation bezeichnet. Es ist daher wichtig, unser Wissen über Biotransformationsenzyme und Detoxifizierungswege zu vertiefen, insbesondere über deren dreidimensionale Strukturen. Diese kumulative Dissertation fokussiert sich auf die Strukturaufklärung zweier Biotransformationsenzyme, der flavinabhängigen Monooxygenase aus Zonocerus variegatus (ZvFMO) und der menschlichen mitochondrialen Amidoxim-reduzierenden Komponente (mARC). FMOs katalysieren die Hydroxylierung von Heteroatom-haltigen Verbindungen, während mARC-Enzyme die Reduktion Heteroatom-hydroxylierter Xenobiotika ausüben. Verschiedene ZvFMO-Strukturen lieferten Erkenntnisse in die Koordination gebundener Kofaktoren und einhergehender Konformationsänderungen. Weiterhin wurde eine bisher unbekannte Dimerformation dieses Enzyms beobachtet. Um tiefere Einblicke in die katalytische Aktivität von ZvFMOs zu erhalten, wurden verschiedene Enzymvarianten untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass vor allem im Substrateingangsbereich schon Einzelaustausche von Aminosäuren einen signifikanten Einfluss auf die Enzymaktivität haben. Die gelöste mARC-Kristallstruktur war die erste MOSC-Proteinstruktur, die Einsicht in die Koordination des Molybdän-Kofaktors gab und eine Topologie aufwies, die bisherigen in silico -Vorhersagen widersprach. Das breite Substratspektrum dieses Enzyms konnte dem oberflächenexponierten aktiven Zentrum zugeschrieben werden. Weiterhin wurden Paralog-spezifische Seitenketten identifiziert, die eine sichere Unterscheidung zwischen mARC1 und mARC2-Proteinen erlauben. Zudem weisen einige strukturelle Merkmale darauf hin, dass mARC-Enzyme ein evolutionäres Bindeglied zwischen zwei Molybdo-Enzymfamilien darstellen, den Sulfitoxidasen und den Xanthinoxidasen.

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Kubitza, Christian: Structural Characterization of Flavin-dependent Monooxygenases from Zonocerus variegatus and the Human Mitochondrial Amidoxime Reducing Component (mARC) – Enzymes involved in Biotransformation. 2018.

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