Insights into the mechanisms of Remote Ischemic Preconditioning : An experimental in vivo/in vitro approach

Short repeated cycles of peripheral Ischemia/Reperfusion (I/R) can protect remote organs (e.g. heart) from subsequent prolonged I/R injury; a phenomenon known as Remote Ischemic Preconditioning (RIPC). A RIPC-mediated release of humoral factors might play a key role in this protection and vascular endothelial cells are potential targets for the secreted factors. In the present study, RIPC-plasma obtained from healthy male volunteers was tested for its ability to protect Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) from hypoxia-induced cell damage. An enzymatic oxygen depletion system was established for HUVEC. Subsequently, 10 healthy male volunteers (25.20 ± 3.39 years) were subjected to a RIPC-protocol consisting of 4 cycles of 5 min inflation/deflation of a blood pressure cuff located at the upper arm. Blood was collected and plasma was retrieved before (T0; control), directly after (T1) and 1 h after (T2) the RIPC procedure. HUVEC were subjected to 24 h of hypoxia and simultaneously incubated with 5 % of the respective RIPC-plasma. Implementation of the oxygen depletion system resulted in augmented cell damage in terms of increased LDH-activity in the cell culture medium of HUVEC (hypoxia versus normoxia, p≤0.0007). Hypoxia-induced cell damage was significantly reduced by RIPC-plasma T1 (p=0.02 versus T0). Western blotting revealed that the protective effect of plasma T1 was accompanied by accumulation of intracellular HIF1alpha (p=0.01 versus T0) and increased phosphorylation of ERK-1/2 (p=0.03 versus T0). Phosphorylation of Akt (p=0.85 versus T0) and STAT5 (p=0.10 versus T0) remained unchanged. Analysis of the protective RIPC-plasma T1 by Sandwich ELISA showed significantly reduced levels of hVEGF (p=0.01 versus T0). However, Spearman rank correlation suggested no significant correlation of hVEGF levels and cell damage (r=-0.48, p=0.17). In conclusion, RIPC-plasma protects endothelial cells from hypoxia-induced cell damage. Humoral as well as intracellular mediators such as HIF1alpha and pERK-1/2 may be involved in RIPC-mediated protection of HUVEC.

Kurze, wiederholte Zyklen peripherer Ischämie/Reperfusion (I/R) können entfernt liegende Organe (z.B. Herz) vor einem nachfolgenden I/R-Schaden schützen; ein unter dem Namen Ischämische Fernpräkonditionierung (Remote Ischemic Preconditioning, RIPC) bekanntes Phänomen. Die RIPC-vermittelte Freisetzung humoraler Faktoren sowie vaskuläre Endothelzellen als deren Zielstrukturen, könnten in der Protektion eine zentrale Rolle spielen. In der vorliegenden Studie wurde RIPC-Plasma gesunder, männlicher Probanden auf die Fähigkeit untersucht, humane Endothelzellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC) vor einem hypoxischen Zellschaden zu schützen. 10 gesunde, männliche Probanden (25.20 ± 3.39 Jahre) wurden einem RIPC-Protokoll mit 4 Zyklen 5 min Inflation/Deflation einer Blutdruckmanschette am rechten Oberarm unterzogen. Plasma wurde aus Vollblut gewonnen, welches vor (T0; Kontrolle), direkt nach (T1) und 1 h nach (T2) dem RIPC-Protokoll abgenommen wurde. Inkubiert mit RIPC-Plasma wurden HUVEC einer enzymatisch-induzierten 24 h Hypoxie ausgesetzt und nachfolgend analysiert. Die Anwendung des Hypoxiemodells induzierte einen Zellschaden im Sinne einer erhöhten LDH-Aktivität im Zellkulturmedium (Hypoxie versus Normoxie, p≤0.0007). Inkubation mit Plasma T1 reduzierte den hypoxischen Zellschaden signifikant (p=0.02 versus T0). Western blotting zeigte unter dem protektiven Effekt von Plasma T1 eine intrazelluläre Akkumulation von HIF1alpha (p=0.01 versus T0) und eine erhöhte Phosphorylierung von ERK-1/2 (p=0.03 versus T0). Die Phosphorylierung von Akt (p=0.85 versus T0) und STAT5 (p=0.10 versus T0) blieb unverändert. Im protektiven RIPC-Plasma T1 zeigten sich mittels Sandwich ELISA signifikant reduzierte Level von hVEGF (p=0.01 versus T0). Eine Spearman Rank Korrelation ergab keine signifikante Korrelation des hVEGF-Levels mit dem induzierten Zellschaden (r=-0.48, p=0.17). Zusammengefasst schützt RIPC-Plasma Endothelzellen vor einem hypoxischen Zellschaden, wobei humorale als auch intrazelluläre Mediatoren wie HIF1alpha und pERK-1/2 eine Rolle spielen könnten.


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