Untersuchung der Abhängigkeit der Funktionalität von Formiat-Nitrit-Transportern vom zentralen Histidin

Helmstetter, Folknand

Die Funktionsweise der FNTs ist trotz der großen pharmazeutischen Relevanz der auf sie angewiesenen Organismen bisher wenig erforscht und wurde bisher durch verschiedene, sich gegenseitig ausschließende Mechanismen erklärt. Während die eine Gruppe den für den Substrat-Proton-Symport nötigen Protonierungsschritt des Substrats einem zentralen Histidin im Transportpfad zuschreibt, wird im dielectric-slide-Mechanismus die Funktionsweise unabhängig von diesem Histidin erklärt. Hier wird konservierten Lysinen an den Transportpfadeingängen die wichtige Rolle der Substrat-Anion-Anziehung zugeschrieben. Um die korrekte Theorie des FNT-Mechanismus zu identifizieren wurden mit den beiden in der Natur vorkommenden FNTs EhFNT aus E. histolytica und BtFdhC1 aus B. thuringiensis erstmalig FNTs untersucht, die an der zentralen Position des Transportpfades statt des üblichen protonierbaren Histidins mit Asparagin (EhFNT) oder Glutamin (BtFdhC1) nicht protonierbare Aminosäuren tragen. Die Lysine an den Transportpfadeingängen sind dagegen vorhanden. Dabei wurde durch Streulichtmessungen an FNT-Liposomen festgestellt, dass beide Ziel-FNTs Monocarboxylate protonengradientenabhängig transportieren. Es konnte zudem gezeigt werden, dass sich die FNTs mit und ohne zentrales Histidin in Bezug auf Substratselektivität und -affinität ähneln. Durch diese Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass nur der dielectric-slide-Mechanismus die Funktionsweise der FNTs korrekt wiedergibt. Da FNTs in Organismen den Import von Substraten oder den Export von metabolischen Endprodukten ermöglichen, sollte in dieser Arbeit auch die Direktionalität von FNTs untersucht werden. Dafür wurde der plasmodiale FNT PfFNT untersucht. Dieser ermöglicht bidirektionalen, Protonengradienten-abhängigen Substrattransport. Nach den aus dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnissen funktionieren FNTs bidirektional nach dem dielectric-slide-Mechanismus.

FNTs are hardly explored even though a variety of pharmaceutical relevant organisms are dependent on them. Their functional mechanism is explained by different mutually exclusive theories. One group identified a central histidine, located in the FNT transport path, as the key for substrate protonation. Another group postulated the “dielectric slide” mechanism which describes substrate protonation independently of the existence of a central histidine. Here the key amino acids are conserved lysines, located at the entrances of the transport path. To clarify which of the postulated mechanisms describes FNT substrate transport correctly two natural FNTs were investigated which carry nonprotonable amino acids instead of histidine in the central position. These FNTs were EhFNT from E. histolytica with a central asparagine, and BtFdhC1 from B. thuringiensis with a central glutamine. Each of them possesses lysines at the transport path entrances. Both investigated FNTs were reconstituted into liposomes and shown to be able to transport monocarboxylates in a proton gradient dependent manner. Furthermore, the substrate selectivity and affinity of FNTs with or without central histidine were proved to be similar. In consequence of these findings the “dielectric slide” mechanism was proved to describe FNT-mediated substrate transport correctly. Since FNTs enable import or export of substrates and metabolic end products, the second aim of this research was to investigate their directionality. It could be shown that the plasmodial FNT PfFNT is able to transport substrates bidirectionally and pH-dependently. The present results could prove that FNTs function bidirectionally in accordance with the “dielectric slide” mechanism.

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Helmstetter, Folknand: Untersuchung der Abhängigkeit der Funktionalität von Formiat-Nitrit-Transportern vom zentralen Histidin. 2019.

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