Zellfreie Synthese und elektrophysiologische Charakterisierung von TREK K2P Kanälen

Musinszki, Marianne ORCID

K2P-Kanäle zeichnen sich durch eine extrazelluläre Kappe und vier Transmembranhelices mit zwei Porendomänen im Tandem aus. Sie wurden in nativen Zellen und heterologen Expressionssystemen durch die Patch-Clamp-Technik untersucht, allerdings können wichtige Fragestellungen besonders gut unter Ausschaltung zellulärer Umgebung an Kanälen in künstlichen Membranen adressiert werden. Die rekombinante Herstellung humaner K2P-Kanäle gelang jedoch bisher nur nach Trunkierung der N- und C-Termini. Die Einzelkanaleigenschaften waren verändert und C-terminal vermittelte Regulationsmechanismen sind nicht untersuchbar. Daher wurde in dieser Arbeit die zellfreie Expression als Herstellungsmöglichkeit vollständiger K2P-Kanäle und deren elektrophysiologische Charakterisierung in künstlichen Membranen etabliert. Die Herstellung war in Weizenkeimextrakt und Tabakzellextrakt erfolgreich. GFP-Fusionsproteine wurden als geeignete Faltungsindikatoren für K2P-Kanäle identifiziert und die Synthese optimiert. Die Translationsreaktion wurde in Anwesenheit von Liposomen durchgeführt, in die K2P-Kanäle direkt insertierten. Die Membranlokalisation wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Die Kanäle zeigten eine präferentielle Orientierung, die eine kotranslationale Insertion impliziert. Die Funktionalität von TREK-Kanälen wurde elektrophysiologisch in Liposomen und planaren künstlichen Membranen gezeigt. hTREK2- und hTREK2-GFP-Kanäle wurden in vertikalen künstlichen Membranen charakterisiert. Die Einzelkanalleitfähigkeiten stimmten mit denen von Wildtypkanälen überein. Die Offenwahrscheinlichkeit war mit 0,5 hoch und deutete auf eine Destabilisierung des weniger aktiven „down“-Zustands durch das verzweigte Lipid DPhPC hin. Die zellfreie Synthese von K2P-Kanälen und deren Charakterisierung in künstlichen Membranen eröffnet die Möglichkeit, offene Fragen insbesondere der Lipidregulation unter definierten Bedingungen zu untersuchen.

K2P potassium channels feature an extracellular cap and four transmembrane helices with two pore domains in tandem. They have been characterised in native cells and heterologous expression systems by the Patch-Clamp technique. However, important problems like regulation by lipids can be explored particularly well in the absence of cellular environment in artificial membranes. Recombinant protein production of human K2P channels was so far only feasible after truncation. Single channel properties of truncated channels were altered, and regulation mechanisms effective at the carboxyterminus cannot be studied. Hence, this thesis establishes cell-free expression as an alternative scheme for production of full-length K2P channels and their electrophysiological characterisation in artificial membranes. Synthesis was successful in wheat germ extract and in tobacco cell lysate. GFP fusion proteins were identified as suitable folding indicators for K2P channels. The translation reaction was performed in presence of different unilamellar liposomes, into which K2P channels were directly incorporated. Membrane localisation in liposomes was assessed by confocal fluorescence microscopy. The channels showed a preferential orientation in the liposomal membrane that indicated a cotranslational insertion mechanism. The function of TREK K2P channels was demonstrated by electrophysiological means in liposomes and planar artificial membranes. Finally, single hTREK2- and hTREK2-GFP channels were electrophysiologically characterised in vertical artificial membranes. hTREK2 channels showed single channel characteristics consistent with wildtype channels. The open probability in artificial membranes was as high as 0.5 and indicated a destabilisation of the low activity 'down' state by the branched Lipid DPhPC. Cell-free synthesis of K2P channels can thus provide an opportunity to further investigate open questions, particularly of lipid regulation, in a well-defined environment.

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Musinszki, Marianne: Zellfreie Synthese und elektrophysiologische Charakterisierung von TREK K2P Kanälen. 2019.

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