Untersuchung zur Bedeutung der sauren Sphingomyelinase für die ADAM10- und ADAM17-Aktivierung im Endothel

Düppe, Marie Magdalena ORCID

ADAM10 („A Disintegrin and Metalloprotease“) und ADAM17 spielen in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Durch das Shedding unterschiedlicher Substrate wie zum Beispiel VE-Cadherin, TNFα-Rezeptor oder den VEGF-Rezeptor-1 wirken sie mit bei der Regulierung von zum Beispiel Adhäsionsprozessen und Entzündungsmechanismen. Ein möglicher Zusammenhang zwischen Lipid Rafts und ADAM17 wurde bereits in der Literatur beschrieben. Da die saure Sphingomyelinase (acid (a-)SMase) Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphorylcholin spaltet und sich die Ceramidmoleküle zu Lipid Rafts formieren, sollte in dieser Arbeit die Rolle der aSMase beim Shedding von ADAM10- und ADAM17-Substraten untersucht werden, sowie eine mögliche Kolokalisierung von Ceramid-reichen Regionen und ADAM17 überprüft werden. In der Literatur wurde bereits beschrieben, dass ADAMs bei Entzündungsprozessen die Permeabilität im Endothel beeinflussen. Deshalb wurde die Bildung von Lipid Rafts, induziert durch die aSMase, auf ihren Einfluss auf die Permeabilität überprüft. Des Weiteren wurde getestet, ob die aSMase die Phosphatidylserin-Externalisierung (PS-Externalisierung) beeinflusst. In dieser Arbeit konnte durch TNFR1-ELISAs, TNFα-AP-Assays, BTC-AP-Assays und Western Blots in COS7-Zellen und HUVECs gezeigt werden, dass eine exogene Zugabe von kurzkettigen und langkettigen Ceramiden das Shedding von ADAM10- und -17-Substraten nicht beeinflusst. Allerdings stellte sich bei den eben genannten Versuchen heraus, dass die Stimulation mit der aSMase zu einer deutlichen Aktivitätssteigerung beider Enzyme führte. Mittels ICC-Färbungen zeigte sich, dass eine Stimulation mit aSMase zur Bildung von Ceramid-reichen Region in COS7-Zellen und HUVECs führte. Die Anfärbung mit dem Choleratoxin B zeigte die Bildung von Ceramid-reichen Lipid Rafts in der Zellmembran und eine gleichzeitige Kolokalisation mit ADAM17 nach 15, 30 und 120 Minuten. Es konnte ebenfalls beobachtet werden, dass die mit aSMase stimulierten HUVECs lange Ausläufer bilden, in denen sich Ceramid anhäufte. Annexin V-FITC-Färbungen zeigten eine PS-Externalisierung nach der Stimulation von COS7- Zellen und HUVECs mit der aSMase nach 15 und 30 Minuten, die durch EGTA inhibiert werden konnte.

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Düppe, Marie: Untersuchung zur Bedeutung der sauren Sphingomyelinase für die ADAM10- und ADAM17-Aktivierung im Endothel. 2020.

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