Design, Synthese und Charakterisierung photoschaltbarer Kinaseinhibitoren

Schmidt, Dorian ORCID

Ziel der Photopharmakologie ist die Entwicklung lichtempfindlicher Wirkstoffe, die sich durch Bestrahlung temporär und lokal aktivieren bzw. deaktivieren lassen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden photoschaltbare niedermolekulare Kinaseinhibitoren entwickelt, die eine lichtinduzierte E/Z Isomerisierung eingehen können. Die Inhibitoren sind dabei so konzipiert, dass sie in der E-Konfiguration an ihr Target binden können und in der Z-Konfiguration idealerweise nicht binden können. Als molekulare Schalter wurden stilbenähnliche Systeme, Azobenzole sowie verbrückte Azobenzole (Diazocine) verwendet. Zunächst wurde der zugelassene Kinaseinhibitor Axitinib (Inlyta®, Pfizer) hinsichtlich seiner Eignung als photoschaltbarer Inhibitor untersucht. Axitinib hemmt die Rezeptortyrosinkinase VEGFR2 und ist zur Behandlung des fortgeschrittenen Nierenzellkarzinoms zugelassen. Interessanterweise weist die Molekülstruktur einen stilbenähnlichen Rest auf, der bei Bestrahlung mit Licht isomerisieren kann. Diese Isomerisierung kann dazu genutzt werden, die biologische Aktivität von Axitinib zu regulieren. In der E-Konfiguration stellt die Verbindung einen potenten VEGFR2-Inhibitor mit einem IC50-Wert von 19 nM dar. In der Z-Konfiguration ist die Wirkung hingegen um das 43-fache verringert. In einem in vitro VEGFR2 Kinaseassay konnte gezeigt werden, dass durch gezielte Bestrahlung von (Z) Axitinib mit 385 nm die biologische Wirkung von (E)-Axitinib zum Großteil wiederhergestellt werden kann. Auch in einem Zellproliferationsassay mit humanen Endothelzellen (HUVECs) konnte eine gezielte Photoaktivierung durch Bestrahlung von (Z)-Axitinib demonstriert werden. Allerdings ist diese Photoaktivierung irreversibel, da es bei Bestrahlung des E-Isomers in wässriger Lösung zu einer konkurrierenden [2+2]-Cycloaddition kommt. Um reversibel photoschaltbare Kinaseinhibitoren zu erhalten, wurden daher mit Hilfe von strukturbasiertem Wirkstoffdesign diazocinfunktionalisierte Axitinibderivate entwickelt. Für die Synthese dieser Derivate wurde eine Stannylierung mit anschließender Stille-Kupplung von mono-halogenierten Diazocinen etabliert. Auf diese Weise konnten drei diazocinfunktionalisierte Inhibitoren synthetisiert, charakterisiert und biologisch evaluiert werden. Für die beste Verbindung konnte in einem in vitro VEGFR2 Kinaseassay ein mehr als 47-facher Wirkunterschied zwischen bestrahlter und unbestrahlter Verbindung demonstriert werden. So wurde in der thermodynamisch stabilen Z-Konfiguration keine Kinasehemmung beobachtet, während nach Bestrahlung mit blauem Licht (405 nm) eine starke Inhibition mit einem IC50-Wert von 215 nM nachgewiesen werden konnte. Auf zellulärer Ebene konnten hingegen nur geringe Wirkunterschiede zwischen unbestrahlter und bestrahlter Verbindung gezeigt werden. In einem weiteren Projekt wurden photoschaltbare Derivate der zugelassenen Kinaseinhibitoren Imatinib (Glivec®, Novartis) und Nilotinib (Tasigna®, Novartis) synthetisiert. Diese beiden strukturell verwandten Inhibitoren sind zur Behandlung von chronisch myeloischer Leukämie (CML) zugelassen und hemmen u.a. die Tyrosinkinasen BCR-ABL sowie PDGFRβ. Um die Verbindungen photoschaltbar zu machen, wurde ein N-Arylbenzamid-Rest der Moleküle durch einen entsprechenden Azobenzol-Photoschalter ersetzt. Für die so erhaltenen Verbindungen “Azoimatinib” und “Azonilotinib” konnte zwar eine reversible Photoschaltung demonstriert werden, allerdings wurde in verschiedenen in vitro Kinaseassays aufgrund der veränderten Molekülstruktur keine nennenswerte Kinasehemmung beobachtet. Für zwei weitere photoschalbare Derivate, bei denen die genannte N-Arylbenzamid-Struktur erhalten wurde, konnte zwar zum Teil eine hohe Kinase-Inhibition gezeigt werden, allerdings konnte keine Photoregulation der Wirkung nachgewiesen werden.

The goal of photopharmacology is to develop light responsive active pharmaceutical ingredients (API) that can be spatiotemporally activated and deactivated by light. In this study, photoswitchable small molecule kinase inhibitors (SMKI) have been synthesized and characterized. These molecules can undergo a photoinduced E/Z isomerization and are designed to be pharmacologically inactive in the Z configuration, but pharmacologically active in the E configuration. As molecular switches stilbene-like systems, azobenzenes and bridged azobenzenes (diazocines) have been utilized. First, the applicability of the approved kinase inhibitor axitinib (Inlyta®, Pfizer) as a photoswitchable inhibitor has been investigated. Axitinib targets the receptor tyrosine kinase VEGFR2 und is licensed for second-line therapy of advanced renal cell carcinoma (RCC). Interestingly, axitinib possesses a stilbene-like moiety allowing for light-induced E/Z isomerization. This feature can be used to control the biological activity of axitinib. In the E configuration axitinib is a highly potent VEGFR2 inhibitor with an IC50 value of 19 nM, whereas (Z) axitinib is about 43 times less active. In an in vitro VEGFR2 kinase assay it was possible to restore the biological activity of (E) axitinib by irradiating (Z) axitinib with UV light (385 nm). An activation of (Z) axitinib by irradiation could also be demonstrated in a human umbilical vein cell (HUVEC) proliferation assay. However, in aqueous solution this photoactivation is irreversible due to a competing [2+2]-cycloaddition of the E isomer. To obtain reversibly photoswitchable kinase inhibitors diazocine-functionalized derivatives of axitinib have been developed by structure-based drug design. For the synthesis of the target molecules a stannylation and a Stille cross-coupling of mono-halogenated diazocines was established. In total three diazocine-functionalized inhibitors haven been synthesized, photochemically characterized and tested in an in vitro VEGFR2 kinase assay. For the best compound a 47-fold increase in activity could be demonstrated upon irradiation. While the thermodynamically stable Z configuration showed no VEGFR2 inhibition, irradiation of the compound with blue light (405 nm) resulted in high VEGFR2 inhibition with an IC50 value of 215 nM. However, in a cell proliferation assay only minor differences could be observed before and after irradiation. Moreover, photoswitchable derivatives of the approved kinase inhibitors Imatinib (Gleevec®, Novartis) und Nilotinib (Tasigna®, Novartis) have been synthesized and characterized. These inhibitors are licensed for chronic myelogenous leukemia (CML) and target the tyrosine kinases BCR-ABL and PDGFRβ. In both cases an N-phenylbenzamide moiety has been replaced by a corresponding azobenzene. The resulting derivatives “azoimatinib” and “azonilotinib” are reversibly switchable, however, no kinase inhibition could be demonstrated in different in vitro assays. Two additional photoswitchable derivatives with retained N phenylbenzamide moiety showed high activities in an in vitro PDGFRβ assay, but no activity differences could be observed upon irradiation.

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Schmidt, Dorian: Design, Synthese und Charakterisierung photoschaltbarer Kinaseinhibitoren. 2019.

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