Die Rolle von Anoctamin 6 für die Aktivierung der Metalloprotease ADAM17

Koyro, Katharina Isabelle ORCID

ADAM17 ist eine der bedeutendsten Metalloproteasen der ADAM-Familie. Viele Substrate werden von ADAM17 prozessiert und freigesetzt. Zu diesen Substraten gehören unter anderem Wachstumsfaktoren und Zytokine, wie AREG oder TGF-α, aber auch Rezeptoren, wie der TNFR1. Diese Vielzahl an bedeutenden Substraten verdeutlicht die essenzielle Rolle, die ADAM17 in physiologischen und pathophysiologischen Prozessen spielt. Trotzdem ist die Regulation der Shedding-Aktivität unzureichend geklärt. Erste Erkenntnisse in vorausgegangenen Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass eine Erhöhung der intrazellulären Calciumionen-Konzentration, aber auch die Aktivität verschiedener Kinasen und die Zusammensetzungen der Plasmamembran, eine wichtige Rolle bei der Regulation des Sheddings spielen. Von besonderer Bedeutung für die ADAM17-Shedding-Aktivität ist die Externalisierung von Phosphatidylserin, die auch ein wesentliches Merkmal der Apoptose ist. So konnte kürzlich gezeigt werden, dass eine transiente Phosphatidylserin-Externalisierung ein zentraler Schlüsselmechanismus für die finale Shedding-Aktivierung sein könnte. Die Plasmamembran ist eine Lipiddoppelschicht mit asymmetrischer Lipidverteilung. Phospholipid-Scramblasen transportieren verschiedene Phospholipide bidirektional. Mehrere Mitglieder der Anoctamin-Familie sind Phospholipid-Scramblasen, wobei ANO6 am umfassendsten für die Externalisierung von Phosphatidylserin untersucht ist. Da ANO6 als eine Calcium-abhängige Phospholipid-Scramblase Phosphatidylserin externalisiert, sollte in dieser Arbeit die Hypothese überprüft werden, dass ANO6 die ADAM17-Shedding-Aktivität bestimmt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine ANO6-Überexpression in HEK-293-Zellen zu einer verstärkten Calcium-abhängigen Phosphatidylserin-Externalisierung führte und zudem mit einer erhöhten Freisetzung von AREG und TGF-α einherging. Durch die Verwendung von teilselektiven ADAM-Inhibitoren konnte dieses Shedding ADAM17, ADAM10 und weiteren nicht identifizierten Metalloproteasen zugeschrieben werden. Eine Stimulation von ADAM17 durch den Proteinkinase C-Aktivator PMA führte nicht zu einer vermehrten Freisetzung von AREG bei einer ANO6-Überexpression. Im Gegenzug führte eine alleinige Überexpression einer Calcium-hypersensitiven ANO6-Mutante bereits ohne Stimulation zu einer immensen Freisetzung von AREG und TGF-α. Dabei wurden ADAM10 und -17 durch Inhibitorexperimente erneut als Haupt-Sheddasen bestimmt. Zusätzlich konnte der beobachtete Zusammenhang zwischen ANO6, der Phosphatidylserin-Externalisierung und dem Shedding von ADAM17-Substraten durch ANO6-Herunterregulationsversuche bestätigt werden. Hierbei führte eine ANO6-Herunterregulation durch siRNA in HUVECs zu einer verminderten Calcium-Ionophor-stimulierten Freisetzung des TNFR1. Die funktionale Relevanz dieses Schlüsselmechanismus konnte zusätzlich in ex vivo Versuchen mit Osteoblasten von Ano6-knockout Mausembryonen und Ano6-heterozygoten Mausembryonen belegt werden. Von Osteoblasten der Ano6-knockout Mausembryonen wurde unter Calcium-Ionophor-Stimulation weniger TNFR1 freigesetzt als von Osteoblasten der Ano6-heterozygoten Mausembryonen. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Arbeit die Hypothese, dass ANO6 die ADAM17-Shedding-Aktivität bestimmt. Zudem könnte möglicherweise auch die Shedding-Aktivität weiterer Metalloproteasen von ANO6 reguliert werden. Dieser Zusammenhang konnte erstmalig mittels in vitro- und auch in ex vivo-Versuchen nachgewiesen werden und ermöglicht ein tieferes Verständnis der Grundlagen der Regulationsmechanismen der untersuchten Proteasen.

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Koyro, Katharina: Die Rolle von Anoctamin 6 für die Aktivierung der Metalloprotease ADAM17. 2020.

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