Charakterisierung der Wirkung und des Wirkmechanismus von pharmakologischen K2P- Kanalagonisten

Tegtmeier, Marie

Zwei- Porendomänen- Kaliumkanäle (K2P- Kanäle) sind die zuletzt entdeckte und am wenigsten erforschte Familie der Kaliumkanäle. Die Familie der K2P-Kanäle umfasst beim Menschen fünfzehn Mitglieder, welche nach Ähnlichkeit ihrer Aminosäuresequenzen in sechs Subfamilien unterteilt werden. Der Name der Kanäle leitet sich aus ihrer Struktur ab, da sie pro Untereinheit zwei porenbildende Domänen und vier Transmembrandomänen besitzen. Funktionelle K2P-Kanäle assemblieren als Dimere, bei denen die insgesamt vier Porendomänen eine kaliumselektive Pore bilden. K2P- Kanäle sind im Menschen ubiquitär mit verschiedenen gewebespezifischen Mustern exprimiert und an diversen (patho-) physiologischen Prozessen beteiligt. Dazu gehören beispielsweise die Regulation der neuronalen Erregbarkeit, der zellulären Signaltransduktion, der Zellproliferation und die Beteiligung an diversen metabolischen Prozessen. K2P -Kanäle scheinen eine Rolle bei der Entstehung einer Reihe von Erkrankungen zu spielen, zu denen Depressionen, kardiale Arrhythmien, Hypertension und verschiedene endokrine Erkrankungen gehören. Daher stellen diese Kanäle potentielle Zielstrukturen für neue Pharmaka dar. Die Offenwahrscheinlichkeit der Kanäle wird durch eine große Bandbreite verschiedener Stimuli, wie Temperatur, Spannung, mechanischer Stress, pH- Wert und endogene Signalmoleküle, genauso wie durch synthetisierte Substanzen beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst verschiedene bekannte K2P- Kanalaktivatoren hinsichtlich ihrer Wirkung und Potenz auf K2P- Kanäle charakterisiert. Die untersuchten Substanzen sind 2- Aminoethoxydiphenylborat, Riluzol, Diphenylboranyloxy- (diphenyl) boran, 3-(3,6-Dichloro-carbazol-9-yl)-propan-1,2-diol, Drofenin und das als BL- 1249 bezeichnete (5,6,7,8-Tetrahydro-naphthalen-1-yl)-[2-(1H-tetrazol-5-yl)-phenyl]-amin. Anschließend wurden die Experimente auf die Aufklärung des Wirkmechanismus des hochaffin auf alle untersuchten Kanälen wirkende BL- 1249 konzentriert. Die Experimente wurden mit der Patch Clamp- Technik durchgeführt. Es wurden große inside- out- Membranpatche aus Xenopus laevis- Oozyten hergestellt, welchen einige Tage zuvor manuell die kanalspezifische mRNA injiziert wurde. Die unterschiedlichen Kanäle zeigten eine Subfamilien- spezifische reversible Aktivierung oder Inhibition bei Applikation der Chemikalien. Am ausführlichsten wurde in dieser Arbeit die Wirkung des Pharmakons BL- 1249 untersucht. Zudem wurde mit der Aufklärung der Bindungsstelle und des Wirkmechanismus von BL- 1249 am TREK- 1- Kanal begonnen; dieser Kanal wird von BL- 1249 sehr potent aktiviert. In K2P- Kanälen ist der Selektivitätsfilter die einzige ins Schaltverhalten involvierte Struktur. Das sogenannte „helix- bundle- crossing“ am intrazellulären Poreneingang beeinflusst die Kaliumleitfähigkeit dagegen nicht. Es wurden neben Kompetitionsexperimenten mit etablierten Kanalblockern einzelne Aminosäuren im Kanalprotein mutiert, um zu klären, ob der mutierte Aminosäurerest eine kritische molekulare Determinante für die Bindung oder den Signaltransfer zum Selektivitätsfilter darstellt. Die Ergebnisse lassen eine Lokalisation der BL- 1249- Bindungsstelle dicht unterhalb des Selektivitätsfilters annehmen. Experimente aus Kooperationen wie Computersimulationen zur molekularen Dynamik, Kristallstrukturen und weiterführende Patch- Clamp- Experimente brachten im Verlauf weitere Erkenntnisse zum Wirkmechanismus von BL- 1249 im Speziellen und allgemein zur Erforschung des Wirkmechanismus von niedermolekularen Substanzen an K2P- Kanälen.

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Tegtmeier, Marie: Charakterisierung der Wirkung und des Wirkmechanismus von pharmakologischen K2P- Kanalagonisten. 2020.

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