The marine flatworm Macrostomum lignano as a model to study immunity, the microbiome and the effects of environmental pollutants

In the current work, I used the marine planarian model organisms Macrostomum lignano to study various aspects of its stress response, ranging from the reaction to toxicants to elucidating its immune system. In all these aspects, the microbiome of this marine flatworm played an important role. Pollutants can accumulate in waters and generate toxicity when concentrations reach certain values on the organism. In M. lignano, I could demonstrate that they reduce the animals’ lifespan, physical activities, and increase the reactive oxygen species formation in both the mitochondrial and the cellular matrix. Compared to the non-drug confronted animals, the numbers of cell deaths significantly increased at higher drug concentrations. Animals displayed differential sensitivity to various drugs. In the present study, worms were more susceptive to copper (Cu) than to cadmium (Cd), with only a trace amount (10 µM) can cause poisonous effects. Various antioxidant enzymes, including prdx6, prdx1, sod2, and mgst1, were down-regulated in response to metal ion confrontation. Gstp1 was the only anti-redox enzyme coding gene that was significantly up-regulated regarding its expression. Moreover, we quantified transcript levels of ABC transporter genes, namely of mdr1, mdr5, and mdr7. They showed either no change or increased transcript levels under drug stress. Toxicologically active compounds not only directly affect physiological functions of worms, but they also influence their corresponding microbiome. M. lignano has a native microbiome under normal lab conditions, which is distinct from the bacterial community associated with its substrates. This points to specific mechanisms that shape the microbiome of the host. In starved animals, a different microbiome could be observed with Stramenopiles and Cytophagales becoming the most abundant bacterial groups. Furthermore, drug-treated animals changed their microbial abundance distribution. Alteronomadaceae were significantly up-regulated in Cu-treated animals; Oceanospirillales and Burkholderiales were increased in Cd-induced animals; Rhodobacterales accumulated in Atr-, Del- and ABD-treated animals; Kiloniellales and Flavobacteriales were found at higher concentrations in Bis-treated animals. Pathogenic bacteria on the other hand act as a biotic stress, which led to dysfunctioning of the animals’ ability to repair wounds. This process of infection-induced the transcription of thousands of unigenes, which could be classified into different gene ontologies. The worms’ innate immune system seems to be composed mainly of three immune-related pathways. The apparently most important pathways include NF-κB, IMD, JNK, and p38 MAPK. Genes like Actin, Rac1, Rho, Rsk, S6K, FGFR, GNBP3, k-Ras, and Shp2, were regulated and are involved in processes such as migration, differentiation, patterning, cell proliferation or morphogenesis. The results of this study provide basic insights into the reaction of M. lignano to different stressors and might help to develop this marine flatworm into a valuable model organism for invertebrate marine organisms.

In der vorliegenden Arbeit, wurde der marine Plattwurm Macrostomum lignano als Modellorganismus verwendet, um insbesondere die Stressantwort auf unterschiedliche toxische Substanzen zu untersuchen und die Aktivierung des Immunsystems genauer zu betrachten. Bei all diesen unterschiedlichen Fragestellungen spielt das Mikrobiom des marinen Plattwurms eine große Rolle. Umweltschadstoffe können sich im Wasser akkumulieren und so für die dort lebenden Organismen toxische Konzentrationen erreichen und diese damit langanhaltend schädigen. In M. lignano konnte ich zeigen, dass die Verwendung toxischer Substanzen die Lebensspanne der Tiere reduziert, die Mobilität stark einschränkt und zu einer intensiv gesteigerten Konzentration an Reaktiven Sauerstoffspezies, sowohl in den Mitochondrien als auch in der zellularen Matrix, der Tiere führt. Im Vergleich zu den Kontrolltieren, nimmt die Apoptoserate in den behandelten Tieren mit zunehmender Konzentration der Substanzen zu. Des weiteren sind die Tiere unterschiedlich sensitiv in Bezug auf die verschiedenen toxischen Substanzen. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Würmer eine höhere Suszeptibilität gegenüber Kupfer-Ionen (Cu) haben als gegenüber Cadmium-Ionen (Cd), denn selbst geringe Kupferkonzentrationen von 10 µM haben einen tödlichen Effekt. Die Analyse der Sequenzierungsdaten zeigte, dass eine Reihe von Antioxidantien nach einer Konfrontation mit Metallionen herunterreguliert waren, darunter waren z. B. prdx6, prdx1, sod2 und mgst1. Eine Ausnahme zeigte das Antiredox-Enzym Gstp1, welches in seiner Expression signifikant verstärkt exprimiert wurde. Ergänzend wurden die ABC Transporter genauer untersucht, insbesondere mdr1, mdr5 und mdr7, welche eine gesteigerte Expression unter den induzierten Stressbedingungen zeigten. Toxisch aktive Substanzen haben nicht nur einen direkten Einfluss auf die Aktivität der Würmer, sondern beeinflussen nachweisbar das Mikrobiom der Tiere. Das Mikrobiom von M. lignano unter Laborbedingungen lässt sich deutlich von dem des Mediums abgrenzen. Daraus lässt sich schließen, dass spezifische Mechanismen vorhanden sein müssen, die das Mikrobiom der Tiere verändern. So zeigte sich in hungernden Tieren eine Verschiebung in der bakteriellen Zusammensetzung in denen Stramenopiles und Cytophagales die am häufigsten auftretenden Bakterienordnungen sind. Außerdem ändert sich die bakterielle Zusammensetzung des Mikrobioms in Abhängigkeit der zugeführten Metallionen. Alteronomadaceae waren signifikant in Cu-behandelten Tieren angereichert; Oceanospirillales und Burkholderiales waren in Cd-induzierten Tieren vermehrt vorhanden; Rhodobacterales waren gehäuft in Atr-, Del- and ABD-behandelten Würmern nachweisbar und Kiloniellales und Flavobacteriales wurden vermehrt in Bis-induzierten Tieren nachgewiesen. Eine weitere Untersuchung galt der Aktivierung des Immunsystems durch Infektion mit pathogenen Bakterien. Diese Form des biotischen Stresses führte dazu, dass die Wundheilung der infizierten Würmer gestört war. Die Transkriptomanalyse der infizierten Würmer zeigte eine deutlich veränderte Regulation mehrerer tausend Gene, welche unterschiedlichen Gengruppierungen zugeordnet werden konnten. Anhand dieser Analyse war es möglich die Struktur des Immunsystems von M. lignano aufzuklären. So sind der NF-B (Imd-) Signalweg, der JNK-Signalweg und die p38 MAPK an der Immunregulation dieser Organismen beteiligt. Gene wie Actin, Rac1, Rho, Rsk, S6K, FGFR, GNBP3, k-Ras und Shp2 wurden stark reguliert und zeigen eine Beteiligung an intrazellulären Prozessen wie Migration, Differenzierung, Mustergebung, Zellproliferation und Morphogenese. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben generelle Einblicke in die Reaktion von M. lignano auf unterschiedlichste Stressoren und stellen somit eine Basis für weitere Untersuchungsmethoden dar, die M. lignano als Modellorganismus für marine Wirbellose auszeichnen.

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