Charkterisierung der Genome verschiedener Lactococcus und Leuconostoc Phagen und Entwicklung eines hochsensitiven und molekularen Nachweisverfahrens für besonders hitzeresistente Phagen der Gruppe 936

Brinks, Erik

Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genome von insgesamt neun Phagen sequenziert und in silico charakterisiert. Über zwei Vertreter der selten gefundenen L. lactis Phagengruppen P087 (P596) und 949 (P1048) konnten verwandschaftliche Beziehungen vertieft werden. Diese seltenen Phagen wurden in jüngster Zeit häufiger isoliert. Das Wissen über diese Gruppen ist jedoch sehr begrenzt, so dass die hier sequenzierten Phagengenome zu einem besseren Verständinis dieser Gruppen beitragen. Ebenfalls selten isolierte Phagen der L. lactis Phagengruppen 1706 (P1046) und Q33 / BM13 (P1045) wurden aus einem Wirtsstamm freigesetzt. Die in silico-Untersuchungen dieser beiden Phagen führte zu der Theorie, es handle sich um einen virulenten und einen ungewöhnlichen, temperenten Phagen. Die Sequenzierung und anschließende in silico-Analyse des Wirtsstammes, in Kombination mit Daten von DNA-DNA-Hybridisierungen ergab, dass es sich bei dem ungewöhnlichen temperenten Phagen um einen sog. Plasmid-Prophagen handelt. Dieser stellt den ersten beschriebenen Plasmid-Prophagen für L. lactis Phagen dar. Drei extrem hitzeresistente Vertreter der als problematisch bekannten L. lactis Phagengruppe 936 wurden ebenfalls sequenziert und in silico analysiert. Ziel war zum einen ein molekularbiologisches Nachweissystem der extrem hitzeresistenten Phagen zu entwickeln. Zum anderen wurde die extreme Hitzeresistenz dieser Phagen untersucht. Für den molekularbiologischen Nachweis konnte die Loop mediated Amplification (LAMP)-Methode adaptiert werden. Anhand des hitzeresistenten Phagen P680 konnte das Potential der Methode demonstriert werden. Die Nachweisgrenze für diesen Phagen wurde im Vergleich zu einem etablierten PCR-Nachweis, bei einer Versuchzeit von unter 90 Minuten, um eine log Stufe reduziert. Bei der Suche nach einer Erklärung für die Hitzeresistenz der sequenzierten 936 Phagen, fiel der Fokus auf das Portal Protein. Dieses Protein ist für die Verbindung zwischen Kapsid und Schwanz der Phagen verantwortlich. Erhitzungsversuche zeigten, das einem hitzeresistenten Vertreter der 936 Gruppe, dem Phagen P1532, die Schwänze und Köpfe selbst bei einer Inaktivierung von 90 % überwiegend als intakte Einheit vorlagen. Im Gegensatz dazu liegen beim hitzesensitiven Vertreter derselben Phagengruppe 936, der Phage P008, bei gleicher Inaktivierung überwiegend leere Köpfe vor, die Schwänze scheinen desintegriert zu sein. Die Sequenzierungen von zwei Leuconostoc spp. Phagen dienten vorrangig dem molekularbiologischen Nachweis dieser beiden Phagen, da mit dem herkömmlichen PCR-Nachweis nicht alle Leuconostoc spp. Phagen detektiert werden konnten. Durch kleine Modifikationen des etablierten Primerpaares gelang es den PCR-Nachweis zu optimieren.

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Brinks, Erik: Charkterisierung der Genome verschiedener Lactococcus und Leuconostoc Phagen und Entwicklung eines hochsensitiven und molekularen Nachweisverfahrens für besonders hitzeresistente Phagen der Gruppe 936. 2019.

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