Isolierung und Charakterisierung von Arabinogalactan-Proteinen aus Gymnospermen und Interaktionsstudien mit humanen Galektinen

Arabinogalactan-Proteine (AGPs) sind Signalmoleküle der pflanzlichen Zellwand mit vielfältigen Funktionen. Während die strukturelle Charakterisierung dieser Glykoproteine für die Angiospermen bereits sehr umfassend bearbeitet wurde, gibt es bisher wenig Wissen über das Vorkommen und die Struktur dieser Moleküle in Gymnospermen. Des Weiteren fehlt es in der Literatur teilweise an einer klaren Abgrenzung gegenüber den Arabinogalactanen (ohne Proteinanteil), die im Holz einiger Gymnospermen in großer Menge vorkommen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit Arabinogalactan-Proteine (AGPs) aus den Gymnospermen Ginkgo biloba, Ephedra distachya, Cycas revoluta und Encephalartos longifolius isoliert und charakterisiert. Die Untersuchung der AGPs bietet interessante Einblicke zu deren evolutionärer Entwicklung. Der Proteingehalt der drei AGPs lag zwischen 5,0-7,5% und damit im Bereich der AGPs der Angiospermen. Die Aminosäure Hydroxyprolin, die in AGPs normalerweise für die Bindung des Polysaccharidanteils verantwortlich ist, findet sich im Proteinanteil von Ginkgo und Ephedra mit Mengen von 6-10% (Ginkgo biloba: 6,8%, Ephedra distachya: 9,5%) im Bereich der Angiospermen-AGPs, während bei Cycas revoluta der Hydroxyprolinanteil mit 22,5% auffällig hoch ist. Der Kohlenhydratanteil aller untersuchten AGPs zeichnet sich durch einen hohen Gehalt an Arabinose aus. Während bei AGPs aus Angiospermen Galactose meist deutlich überwiegt, zeigen alle Gymnospermen-AGPs ein ungefähr ausgeglichenes Ara:Gal-Verhältnis. Ein besonderes Merkmal der untersuchten AGPs (mit Ausnahme des Cycas revoluta AGPs) ist das Vorkommen terminaler 3-O-Methyl-Rhamnose – ein Monosaccharid, welches in AGPs und auch anderen Polysacchariden der Angiospermen nicht vorkommt, in Gymnospermen-AGPs bisher nicht beschrieben wurde und in letzter Zeit in AGPs verschiedener Moose und Farne nachgewiesen werden konnte. Der Kohlenhydratstrukturen der AGPs von Ephedra distachya und Cycas revoluta weisen den typischen Aufbau eines AGs Typ II auf mit dem Hauptverzweigungspunkt 1,3,6-Galactose und einem auffällig hohen Gehalt an terminaler Arabinose. 3-O-Methyl-Rhamnose konnte nur in dem AGP von Ephedra distachya und in jenem von Encephalartos longifolius gefunden werden. Die absoluten Molekulargewichte liegen mit 130-185 kDa im Bereich der AGPs der Angiospermen (Ephedra distachya: 132,6 kDa, Cycas revoluta: 180,9 kDa). Im Gegensatz dazu zeigt das Ginkgo-AGP ungewöhnliche Strukturmerkmale. Es zeichnet sich in den Grundzügen durch die klassischen Monosaccharidstrukturen eines Typ II-Arabinogalactans in der Galactan-Hauptkette wie 1,3,6-Galp, und 1,3-Galp aus. In den Seitenketten zeigen sich auffällig große Mengen an 1,5-Araf und 1-Araf. Zusätzlich wurde der ungewöhnliche Zucker 3-O-Metyhl-Rhamnose als Endgruppe nachgewiesen. Interessanterweise konnte ein sehr hoher Gehalt von 1,4-Galp nachgewiesen werden, welche ein typischer Bestandteil eines AGs vom Typ I ist. Das absolute Molekulargewicht des Ginkgo-AGPs ist mit ca. 520 kDa auffällig groß. Ein neues medizinisches Target, insbesondere in der Tumortherapie, stellen humane Galektine dar, die galactanhaltige Strukturen binden. Aus diesem Grund kommen auch pflanzliche Galactane als potentielle Galektin-Inhibitoren in Frage. Mittels der Bio-Layer-Interferometrie wurden daher kinetische Interaktionsstudien zum Nachweis der Bindung von AGPs an die Galektine-1 und -3 durchgeführt. Dazu wurde Galektin-1 zellfrei exprimiert (Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Eric Beitz) und die Bindung an ein partialhydrolysiertes AGP aus Echinacea purpurea nachgewiesen (KD=1,41 µM). Das native Ginkgo-AGP und dessen verschiedene partialhydrolysierte Derivate mit höherem Galactangehalt und geringeren Molekulargewichten wurden auf Interaktionen mit humanem Galektin-3 untersucht. Dabei zeigte das native AGP die höchste Bindungsaffinität, evtl. bedingt durch eine zusätzliche Bindungsstelle am Galektin außerhalb der CRD, wie es kürzlich für ein Rhamnogalacturonan ermittelt wurde.

Arabinogalactan proteins (AGPs) are signaling molecules of the plant cell wall with a variety of functions. For the angiosperms, the structures of these glycoproteins have already been investigated extensively, whereas there is little knowledge about the occurrence and structural composition of these molecules in gymnosperms. Furthermore, literature does not provide a clear separation from arabinogalactans (without a protein content), which are found in large quantities in the wood of some gymnosperms. For this reason, AGPs from the gymonsperms Ginkgo biloba, Ephedra distachya, Cycas revoluta and Encephalar-tos longifolius were isolated and characterized. These studies of gymnosperm-AGPs offers interesting insights into their evolutionary development. The protein content of the three AGPs (Ginkgo, Ephedra, Cycas) is between 5.0-7.5% and thus in the range of the AGPs of angiosperms. For Ginkgo biloba: 6.8% and Ephedra distachya: 9.5%, the amount of the amino acid hydroxyproline, which is normally responsible for binding the polysaccharide fraction, is, with amounts of 6-10%, comparable to that of angiosperm-AGPs. In contrast, the hydroxyproline fraction is conspicuously high (22.5%) in the Cycas revoluta AGP. The carbohydrate content of all examined AGPs is characterized by a high amount of arabinose. Galactose predominates most angiosperms-AGPs, whereas all investigated gymnosperm-AGPs showed comparatively balanced Ara:Gal ratios. An interesting feature of the AGP (with the exception of the Cycas revoluta AGP) was the occurrence of terminal 3-O-Methyl-Rhamnose, a monosaccharide which does not occur in AGPs and other polysac-charides of angiosperms and has not yet been described in gymnosperm-AGPs. However, the occurrence of 3-O-Me-Rhap in different mosses and ferns has been recently reported. The carbohydrate structures of the AGPs from Ephedra distachya and Cycas revoluta show the typical structure of a type II AG, which is 1,3,6-Galp as the main branch point and a high amount of terminal arabinose. 3-O-Me-Rhap was only found in the AGPs of Ephedra distachya and Encephalartos longifolius. The absolute molecular weights of 130-185 kDa are comparable to those of the angiosperm-AGPs (Ephedra distachya: 132.6 kDa, Cycas revoluta: 180.9 kDa). In contrast, the AGP of Ginkgo biloba showed unusual structural features. The main galactan chain is characterized by the classical monosaccharide structures of a type II arabinogalactan, like 1,3,6-Galp and 1,3-Galp, accompanied by high amounts of 1,5-Araf and 1-Araf. Additionally, the unusual terminal monosaccharide 3-O-Me-Rhap was also detected. Interestingly, a very high content of 1,4-Galp was detected, which is a typical component of a type I arabinogalactans. The absolute molecular weight of the Ginkgo-AGP (520 kDa) is very high. A new medical target, especially in tumor therapy, are human galectins, which bind ga-lactan structures. Consequently, herbal galactans can also be considered as potential galectin inhibitors. Therefore, kinetic interaction studies were performed by utilising bio-layer-interferometry to investigate the binding of AGPs to galectin-1 and -3. For this purpose, a cellfree galectin-1 was expressed (cooperation with working group of Prof. Dr. Eric Beitz, CAU Kiel) and a binding to a partial hydrolized AGP from Echinacea purpurea was detected (KD=1.41 µM). The native Ginkgo-AGP and the various partially hydrolyzed AGP-derivates with high galactan content and lower molecular weights were investigated for interactions with human galectin-3. The native AGP showed the highest binding affinity, which could be a result of an additional binding site on the galectin outside of the CRD, comparable to the one that was recently found for a rhamnogalacturonan.

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