Aktivierungs-abhängige Mobilisierung zytotoxischer Effektorproteine in humanen T-Lymphozyten
Zytotoxische T-Lymphozyten eliminieren virusinfizierte oder entartete Zellen mit Hilfe zytotoxischer Effektorproteine, die in Lysosomen-verwandten Effektorvesikeln (LREV) gespeichert werden. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass zwei unterschiedliche Entitäten von LREV existieren, die sich in Dichte und Proteinbeladung unterscheiden. Die sog. sekretorischen Lysosomen enthalten den Apoptose-induzierenden Fas-Ligand (FasL) und die 15 kDa Form von Granulysin, die neben einer antimikrobiellen auch eine immunmodulatorische Wirkung aufweist. In sog. dichten Granula werden die zytotoxischen Effektorproteine Granzym A und Granzym B, Perforin und das prozessierte 9 kDa Granulysin gespeichert. Die Lysosomen-assoziierten Membranproteine CD63 und CD107a kolokalisieren nach aktuellen Imaging-Analysen vermehrt mit dichten Granula. Die beiden Entitäten der LREV sind außerdem mit unterschiedlichen Zytoskelett-Elementen assoziiert, was eine differenzierte Mobilisierung nahelegt. So konnten bereits Unterschiede in Stimuli und Transportmechanismen für den FasL, Granzym B, CD107a und CD63 aufgezeigt werden. An diese Ergebnisse anknüpfend wurde in dieser Arbeit die aktivierungs-abhängige Mobilisierung der beiden Granulysin-Formen näher untersucht. Hierfür wurde zunächst die selektive Speicherung von 9 kDa und 15 kDa Granulysin in unterschiedlichen LREV verifiziert. Anschließend wurden T-Lymphozyten u.a. unter Einsatz verschiedener Inhibitoren des Zytoskeletts mit Phorbolester und Ca2+-Ionophor stimuliert. Mittels Immunpräzipitation und Western-Blot wurden die beiden Granulysin-Formen in den Kulturüberständen analysiert. Auf diese Weise wurde nachgewiesen, dass das 15 kDa Granulysin Ca2+-unabhängig und Aktin-abhängig mobilisiert wird. Dies steht im Einklang mit der aktivierungs-abhängigen Mobilisierung des FasL, der ebenfalls in sekretorischen Lysosomen gespeichert wird. Das 9 kDa Granulysin wird hingegen Ca2+-abhängig freigesetzt und folgt damit hinsichtlich seiner Mobilisierung dem ebenfalls in dichten Granula gespeichertem Granzym B. Darüber hinaus wurden LREV aus T-Lymphozyten über Dichtegradientenzentrifugation angereichert und mittels Western-Blot überprüft, ob bekannte lysosomale Transportproteine selektiv in der einen oder anderen Entität von LREV nachweisbar sind. Hierbei konnte gezeigt werden, dass sich die beiden Entitäten auch in ihrer Assoziation mit Transportproteinen unterscheiden. Sowohl dieser Befund als auch die Unterschiede in der aktivierungs-abhängigen Mobilisierung der beiden Granulysin-Formen liefern weitere Hinweise für eine selektive Mobilisierung der unterschiedlichen Effektor-Vesikel. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass zytotoxische T-Lymphozyten Kontext-abhängig und gezielt bestimmte zytotoxische Effektorproteine freisetzen und damit bedarfsgerecht auf entartete oder infizierte Zellen reagieren können.
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