Arzneimittelresistenz-assoziierte, protozoische Membranproteine : Untersuchungen zur Struktur und Inhibitorfindung des plasmodialen Chloroquin-Resistenz-Transporters sowie zum Pentamidin-Aufnahmemechanismus über das trypanosomale Aquaglyceroporin 2

Die Kontrolle der vektorübertragenen Krankheiten Malaria und humanen afrikanischen Trypanosomiasis hängt von der Wirksamkeit der verfügbaren Chemotherapeutika ab. Zwei membranständige Transportproteine der protozoischen Erreger Plasmodium falciparum und Trypanosoma brucei werden mit Arzneistoffresistenzen in Verbindung gebracht. Insbesondere die Verwendung von Chloroquin als kosteneffizienten antiplasmodialen Arzneistoff mit umfangreicher klinischer Erfahrung ist dadurch eingeschränkt. Der plasmodiale Chloroquin-Resistenz-Transporter (PfCRT) ist eine potenzielle pharmakologische Zielstruktur. Ein Ziel dieser Arbeit war die rekombinante Produktion und Reinigung, um korrekt gefaltetes, reines Protein in großen Mengen einer Strukturaufklärung zugänglich zu machen. Basierend auf einem Ribosomenextrakt aus Escherichia coli wurde der Wildtyp PfCRT-3D7 in einem zellfreien System produziert und mittels Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie gereinigt. Durchschnittlich wurden 1,5 mg Protein pro ml des zellfreien Reaktionsansatzes hergestellt. Die Qualität wurde mit Hilfe eines C-terminal fusionierten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) als Faltungsindikator und mittles Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bewertet. SDS-resistente Oligomere und TEM-Bilder von in Brij® 78 solubilisiertem PfCRT indizierten eine Dimerisierung, welche für eine zukünftige Strukturaufklärung mittels Kryo-EM von Vorteil sein könnte. Ein weiteres Ziel war die Etablierung eines target-basierten Assays zur Inhibitorfindung, wozu PfCRT-3D7 in Saccharomyces cerevisiae exprimiert wurde. Ein Chloroquin-Influx über PfCRT-3D7 in das Hefezytosol manifestierte sich in einer Wachstumsbeeinträchtigung. Diese wurde in einem turbidimetrischen Assay in einem 100-well-Plattenformat überwacht. In der Malaria-Box (Medicines for Malaria Venture) wurde kein Inhibitor von PfCRT-3D7 gefunden, der das durch 10 mM Chloroquin gestörte Wachstum regenerieren konnte. Die Expression der mit einer Resistenz assoziierten Variante PfCRT-Dd2 mit acht Mutationen führte zu einer stärken Wachstumsbeeinträchtigung. Dieses Ergebnis ist konsistent mit der Hypothese, dass ein mutierter PfCRT die Hauptdeterminante für die Chloroquinresistenz ist. In T. brucei wird der Mechanismus der Aufnahme des antitrypanosomalen Arzneistoffs Pentamidin über das Aquaglyceroporin 2 (TbAQP2) kontrovers dikutiert. In diesem Zusammenhang verwendeten einige Studien Ionophore. Diese Arbeit zeigt einen inhibitorischen Effekt von CCCP und Gramicidin auf die Funktion von TbAQP2 und TbAQP3 bei Verwendung eines neutralen Soluts bei neutralem pH-Wert. Dies verdeutlicht die Bedeutung geeigneter Kontrollen beim Einsatz von Ionophoren. Des Weiteren sollte der Aufnahmemechanismus mit einem biotin-gekoppelten Pentamidinderivats untersucht werden. Wie Pentamidin verhielt sich dieses als nanomolarer Inhibitor der Glycerolpermeabilität von TbAQP2, welche durch Lichtstreumessungen von osmotisch empfindlichen S. cerevisiae ermittelt wurde. Die Viabilität von Trypanosomen wurde nicht beeinträchtigt. Eine unspezifische Bindung an die Trypanosomenoberfläche behinderte die mikroskopische Überprüfung der vorgeschlagenen rezeptorvermittelten Endozytose.

The control of the vector-borne diseases malaria and human African trypanosomiasis depends on the effectiveness of available chemotherapeutic agents. Two membrane transport proteins of the protozoan pathogens Plasmodium falciparum and Trypanosoma brucei are associated with drug resistance. In particular, the use of chloroquine as a cost-effective anti-plasmodial drug with extensive clinical experience is limited by resistance. Hereof, the plasmodial chloroquine resistance transporter (PfCRT) is a potential drug target. We aimed at a recombinant production and purification to provide properly folded, pure protein in large quantities amenable to structural elucidation. Based on an Escherichia coli ribosome extract, wild type PfCRT-3D7 was produced using a cell-free system and purified by affinity and size exclusion chromatography. An average of 1.5 mg of protein per ml of the cell-free reaction mixture was produced. Quality was assessed by using C-terminally fused green fluorescent protein (GFP) as a folding indicator and by transmission electron microscopy (TEM). SDS-resistant oligomers and TEM images of PfCRT solubilized in Brij® 78 indicated dimerization, which may promote future structural elucidation by cryo-EM. Furthermore, we aimed at establishing a target-based assay for inhibitor discovery by expressing PfCRT-3D7 in Saccharomyces cerevisiae. Chloroquine influx via PfCRT-3D7 into the yeast cytosol manifested in a growth impairment. This was monitored by a turbidimetric assay in a 100-well plate format. Within the malaria box (Medicines for Malaria Venture), we found no inhibitor of PfCRT-3D7 that was able to regenerate the impaired yeast growth in the presence of 10 mM chloroquine. The more severe growth impairment by expression of PfCRT-Dd2 carrying eight mutations is consistent with the hypothesis that a mutant PfCRT is the main determinant for chloroquine resistance. In T. brucei, the uptake mechanism of the antitrypanosomal drug pentamidine via the aquaglyceroporin isoform 2 (TbAQP2) is controversially dicussed. In this context, some studies based their findings on ionophore dependent effects. This work demonstrates an inhibitory effect of CCCP and gramicidin on the function of TbAQP2 and TbAQP3 upon using a neutral solute at neutral pH. This emphasizes the relevance of appropriate controls in the experimental employment of ionophores. Furthermore, we aimed at exploring the uptake mechanism od pentamidine using a biotin-coupled derivative. Like pentamidine, the derivative was a nanomolar inhibitor of the glycerol permeability of TbAQP2, which was determined by light scattering measurements of osmotically sensitive S. cerevisiae. In contrast, the viability of trypanosomes was not affected. Nonspecific binding to the trypanosome surface hindered a microscopic examination of the proposed uptake via receptor-mediated endocytosis.

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