Untersuchung der Auswirkung von Retinol/Entzündung auf gingivale Stamm- und Progenitorzellen

Parodontitis ist eine Entzündung des Zahnhalteapparats, welche unbehandelt zur Destruktion von Desmodont, Zement, Alveolarknochen und Gingiva führt. Die biologische Reaktion auf die parodontalen Pathogene und die damit verbundenen Virulenzfaktoren beinhaltet eine massive Freisetzung proinflammatorischer Zytokine in den parodontalen Geweben, einschließlich Interleukin-1-β (IL-1-β), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-6 (IL-6), Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) und später Interferon-γ (IFN-γ). Diese entzündlichen Zytokine beeinflussen dabei den Verlauf von Parodontitis, Reparatur und Regeneration. Gingivale mesenchymale Stamm-/Vorläuferzellen (G-MSCs) zeigen parodontale reparative/regenerative Fähigkeiten mit Resistenz gegen Entzündungsreize und lokale immunmodulatorische Eigenschaften. Vitamin A und seine Metaboliten sind entzündungsmodulierende Biomoleküle, die zusammen mit dem lokalen entzündlichen Mikromilieu die verschiedenen physiologischen Wirkungen wie Proliferation, Stoffwechsel, Differenzierung und Zellwachstum/Apoptose von G-MSCs beeinflussen. Darauf aufbauend war das Ziel dieser Arbeit die erstmalige Untersuchung der kontrollierten Entzündungs- und Retinol-Effekte, isoliert und kombiniert, auf das Pluripotenz-, Proliferations- und Differenzierungspotential von G-MSCs in-vitro. Um Stammzellen für das aktuelle Experiment zu gewinnen, wurde Gingiva, nach Extraktion von dritten Molaren, isoliert. G-MSCs (n = 5) wurden STRO-1-immunmagnetisch sortiert (MACS-Sorting), wodurch die Stammzellen, die MACS-positiven Zellen von den anderen Zellen, MACS-negativen Zellen, getrennt wurden. Um nachzuweisen, dass es sich bei den MACS-positiven Zellen um Stammzellen handelt, wurde diese entsprechend der definierten Kriterien des International Society for Cellular Therapy (ISCT) charakterisiert (Dominici et al., 2006): a) Adhärenz an Gewebekulturplatten und Bildung von koloniebildenden Einheiten nach 14 Tagen, b) die Expression der Oberflächenantigene CD73, CD90 und CD105 bzw. keine Expression von CD14, CD34 und CD45 mittels Fluoreszenz- (FACS-) Analyse, c) das Vorweisen eines multipotenten Differenzierungspotenzial (osteogen, adipogen und chondrogen). Im Rahmen des Hauptexperiments wurden die G-MSCs entsprechend vier Gruppen stimuliert: Die Kontrollgruppe wurde in basischem Medium, die Entzündungsgruppe in basischen Medium mit Entzündungszytokinen (IL-1β (1 ng/ml), TNF-α (10 ng/ml) und IFN-γ (100 ng/ml)), die Retinolgruppe in basischem Medium mit Retinol (20 μmol/l) und schließlich die Entzündungs-/Retinolgruppe mit Retinol (20 µmol/l), das dem Entzündungsmedium zugesetzt wurde, kultiviert. Untersucht wurden die β-Catenin-Spiegel nach 1 Stunde, die Zellproliferation über 14 Tage und koloniebildende Einheiten (KBE) nach 14 Tagen. Pluripotenz-Genexpressionen wurden nach 1, 3 und 5 Tagen mittels Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Nach 5 Tagen wurde das Differenzierungspotenzial unter Verwendung von qualitativer und quantitativer Histochemie und RT-PCR bewertet. Außerdem wurde eine osteogene, adipogene und chondrogene Differenzierungsreihe untersucht. Es zeigte, dass das intrazelluläre β-Catenin in den stimulierten Gruppen signifikant abnahm. Die Zellproliferation zeigte nach 72 Stunden die stärkste Ausprägung in der Kontroll- und Entzündungsgruppe, gefolgt von der Retinolgruppe. Nach 14 Tagen wies die Retinolgruppe die höchsten koloniebildenden Einheiten auf. Auf mRNA Ebene wurde Nanog am häufigsten in der Entzündungs- und Retinolgruppe exprimiert. Die Entzündung erhöhte die Sox2-Expression signifikant, während die Expression in der Retinol- und Entzündungs- /Retinolgruppe verringert war. Bei der Untersuchung der multipotenten Differenzierung wies die Retinol-/Entzündungsgruppe das höchste Potential auf. Die Ergebnisse zeigen, dass eine kontrollierte kurzzeitige Stimulation mit Entzündung bzw. Retinol den Wnt/β-Catenin-Signalweg aktivieren und die Pluripotenz, Proliferation und Differenzierung von G-MSCs positiv beeinflussen. Die vorliegenden Ergebnisse liefern weitere Einblicke in die entzündlich-regenerativen Wechselwirkungen und ihr Modulationspotential für die durch G-MSCs vermittelte parodontale Reparatur/Regeneration.

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