Die Metalloprotease ADAM17 : Entwicklung potenzieller Makrophagen-spezifischer Inhibitoren und Beeinflussung durch Inhibitoren des Interleukin-6 Rezeptors

Die Metalloprotease ADAM17 besitzt ein breites Spektrum von über 80 verschiedenen Substraten und ist in den vergangenen Jahren mit einer Vielzahl an pathologischen Prozessen wie beispielsweise Krebs, entzündlichen Darmerkrankungen oder Nierenerkrankungen in Verbindung gebracht worden. Obwohl ADAM17 ein vielversprechendes therapeutisches Zielmolekül ist, hat bisher aufgrund von mangelnder Spezifität für ADAM17 und daraus resultierenden Nebenwirkungen noch kein Inhibitor eine klinische Zulassung erhalten. Ein möglicher Kandidat hierfür ist die Prodomäne der Protease, für die sowohl in vitro als auch in vivo im Mausmodell eine spezifische Inhibition von ADAM17 gezeigt werden konnte. Da sich die rekombinante prokaryotische Expression von ADAM17 Prodomäne in der Vergangenheit als schwierig erwies, erfolgte im Rahmen dieser Arbeit zunächst ein Expressionsversuch der Prodomäne im eukaryotischen Expressionssystem. Die Prodomäne konnte in HEK293T-Zellen erfolgreich exprimiert werden und zeigte ein höheres Molekulargewicht als prokaryotisch exprimierte Prodomäne, was auf posttranslationale Modifikationen schließen lässt. Eine Reinigung und funktionelle Testung der Prodomäne war nicht zufriedenstellend möglich und muss in Zukunft optimiert werden. Selbst bei spezifischer Inhibition nur von ADAM17 ist mit komplexen Nebenwirkungen zu rechnen, da die ubiquitär exprimierte Protease auch an einer Vielzahl physiologischer Funktionen, wie z. B. der Regeneration des Darmepithels, der Aufrechterhaltung der Hautbarriere und der Immunabwehr, beteiligt ist. Es ist daher wünschenswert, pathogen wirkendes ADAM17 eines bestimmten Zelltyps selektiv therapeutisch zu inhibieren ohne protektiv wirkendes ADAM17 eines anderen Zelltyps zu beeinflussen. Mit diesem Ziel sollten im Rahmen dieser Arbeit potenzielle Makrophagen-spezifische ADAM17-Inhibitoren entwickelt werden. Dazu wurden zunächst mehrere Einzeldomänenantikörper (VHHs), welche spezifisch an Oberflächenmoleküle von Makrophagen binden, erfolgreich in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Anschließend wurde ihre Funktionalität mittels Durchflusszytometrie bestätigt. Daraufhin wurden verschiedene Fusionsproteine, bestehend jeweils aus einem VHH sowie der inhibitorischen ADAM17 Prodomäne, entworfen, kloniert und erfolgreich in HEK293T-Zellen exprimiert. Inwiefern die Fusionsproteine tatsächlich eine zellspezifische Inhibition der Protease ermöglichen, ist aktuell noch offen. Löslicher Interleukin-6 Rezeptor (sIL-6R) kann mit Interleukin-6 (IL-6) einen Komplex bilden, welcher daraufhin Glykoprotein130 exprimierende Zellen aktivieren kann, auch wenn diese keinen membranständigen IL-6R exprimieren. Dieser als Trans-Signalweg bezeichnete Prozess ist hauptsächlich für die proinflammatorischen Wirkung von IL-6 verantwortlich. Der Großteil des sIL-6R wird durch Proteolyse des membranständigen IL-6R generiert. ADAM17 gilt hierfür unter inflammatorischen Bedingungen als hauptverantwortliche Protease. Bisher war unklar, ob die klinisch eingesetzte therapeutische Blockade des IL-6R, z. B. durch den monoklonalen Antikörper Tocilizumab, die proteolytische Generierung des sIL-6R durch ADAM17 beeinflusst. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sowohl Tocilizumab als auch ein anti-IL-6R VHH effektiv den IL-6R blockieren, jedoch keinen Einfluss auf die proteolytische Generierung des sIL-6R haben.