Elektrophysiologische Untersuchung der strukturellen Schaltmechanismen im TREK1-Kanal
Mittels eines Cysteinscans habe ich große Bereiche des TREK-1-Kanales mit Hilfe von 82 Punktmutationen untersucht. Dabei habe ich 49 Mutationen identifiziert, welche die Grundaktivität des Kanals erhöhen. Eine Projektion dieser Mutationen auf den ’up’- und den ’down’-Zustand legt nahe, dass die Zunahme der Kanalaktivität der Mutationen durch Destabilisierung von Aminosäure-Wechselwirkungen im ’down’-Zustand erfolgt. Dieser Befund impliziert, dass der ’down-Zustand’ einen inaktiven Zustand und die Überführung in den ’up-Zustand’ einen maßgeblichen Vorgang der Kanalaktivierung darstellt. Im Detail wurden folgende besonders kritische Wechselwirkungen im ’down’-Zustand identifiziert: (i) ein Cluster (Interaktions-Triade) von TREK1-E208 (M2), -R222 (M3) und -W310 (M4), (ii) eine π - π -Interaktion von TREK1-F229 und -F200 und (iii) Reste in der Nähe dieser Wechselwirkungscluster. Die Aktivierung durch sauren intrazellulären pH ist in diesen mutierten TREK-1 Kanälen stark reduziert und impliziert, dass die pH-Aktivierung durch Induktion der ’up’-Konformation hervorgerufen wird.
Des Weiteren wurde die Zustandsabhängigkeit der chemischen Modifizierung der eingeführten Cysteine untersucht. Es wurde eine Reihe von Positionen identifiziert, die im aktivierten Zustand bei pH 5 nur wenig bis gar nicht, aber gut im inaktiven Zustand bei pH 8 modifiziert werden. Diese Ergebnisse sind ebenfalls in prinzipieller Übereinstimmung mit dem Konzept der pH-Aktivierung durch Destabilisierung des ’down’-Zustandes, wenn auch nicht alle Ergebnisse dadurch erklärbar sind.
Meine Ergebnisse erweitern unser Verständnis der strukturellen Aktivierungsmechanismen in TREK-1-Kanälen und implizieren, dass die Stabilisierung des inaktiven ’down’-Zustandes dabei ein zentraler Vorgang ist.
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