Wasser- und Protonenausschluss in Formiat-Nitrit-Transportern

Formiat-Nitrit-Transporter (FNT) sind in einzelligen Organismen vorkommende Membranproteine, die bidirektional schwache Säuren leiten. Sie bilden aus Protomeren mit je sechs α-helikalen Transmembranspannen Homopentamere, die so fünf voneinander unabhängige Transportporen aufweisen. Jede davon ist durch dieselben hoch-konservierten Aminosäuren geformt, wobei die markanteste ein zentral gelegenes Histidin zwischen zwei ebenfalls hoch-konservierten hydrophoben Konstriktionen ist. In der Literatur sind drei Hypothesen über den Mechanismus der Substratpassage durch FNT postuliert. Der proton-relay-Mechanismus beinhaltet ein protoniertes Histidin, wohingegen der dielectric-slide-Mechanismus ein konstant neutrales Histidin beschreibt. Neuere in-vivo-Studien postulieren ein nur beim Substratimport protoniertes Histidin. Der größte Disput kommt demnach dem zentralen Histidin und dessen Protonierungszustand zu. Zudem schreibt keiner der Mechanismen den konservierten Konstriktionen eine Beteiligung am Substrattransport zu. Durch zielgerichtete in-vitro-Mutagenese und heterologe Expression in der Hefe wurde mit dieser Arbeit die Rolle der Konstriktionen und des zentralen Histidins mit Hilfe von Substrataufnahmeassays erforscht. Erhebungen zur Transportrate, pH-Kopplung, Substrataffinität, Aktivierungsenergie, zu Schwerwassereffekten und zum veränderten Substratspektrum nach Erweiterung der Konstriktionen von zwei FNT (EcFocA und PfFNT) ordnen den hydrophoben Konstriktionen eine direkte Funktion als Filterregion zu. Sie bedingen den Ausschluss von Wasser, kleinen neutralen Soluten und Protonen. Die Ergebnisse suggerieren zusätzlich ein während der endogenen Substratpassage konstant neutrales Histidin. Diese Arbeit identifiziert so erstmalig die Wasser- und Protonenbarriere in FNT und stützt den dielectric-slide-Mechanismus.

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