Zellfreie Protein-Produktion zur Target- und Substrat-Evaluation
Für die Entwicklung neuartiger Antibiotika stellt die Target-Identifizierung einen kritischen Schritt in der Entdeckung neuartiger Antibiotika dar. Für die Target-Identifizierung von Antibiotika steht unter anderem die zellfreie Proteinsynthese zur Verfügung. Weiterhin findet die zellfreie Proteinsynthese Anwendung für die Synthese von Membranproteinen. Von besonderem Interesse im Kontext der Membranproteine ist die Identifizierung neuer Substrate. Eine neuartige Hochdurchsatz-Methode, stellt die Bio-Layer-Interferometrie (BLI) dar. Eine Nutzung der BLI zum Substrat-Screening für Membranproteine würde eine neue Anwendung schaffen. In dieser Arbeit werden zwei verschiedene Fragestellungen angegangen. Einerseits wird ein effektives zellfreies in vitro Screening-System für Inhibitoren der bakteriellen Ribosomenaktivität mit direkter Fluoreszenzmessung beschrieben. Die Fluorophorbildung des grün fluoreszierenden Proteins oder des monomeren NeonGreen erfolgt innerhalb einer Stunde und benötigt ein geringes Volumen. Zum Zweiten wird in dieser Arbeit für die Etablierung der BLI als Substrat-Screening-Methode ein Testsystem eingeführt. Hier wurden die beiden Aquaglyceroporine Plasmodium falciparum (PfAQP1) sowie die Isoform 2 aus Trypanosoma brucei (TbAQP2) zellfrei synthetisiert und in Liposomen rekonstituiert. Die Funktionalität der Liposomen wurde anhand einer Charakterisung des Schrumpf- und Schwellverhalten gegenüber verschiedenen hyperosmotischen Zuckeralkoholen an der stopped flow-Methode gezeigt.
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