Using Chimera Proteins with the Trp-Cage in the Development of Photoswitchable Antifreeze Proteins

In dieser Arbeit wurde die N-terminale Wiederholungseinheit des helikalen Antigefrierproteins HPLC-6 mit der N-terminalen Helix des Trp-cages überlappt. In einem Proteinchimären-Ansatz wurden sechs Analoga mit gleicher Komposition und Sequenzlänge designt, in denen ein Lysin systematisch um jeweils eine Aminosäure versetzt wurde.

Zunächst wurde der Einfluss der Lysin-Seitenkette auf Faltung und Lage der eisbindenden Seite der Proteinchimären untersucht. Die spektroskopischen Untersuchungen ergaben eine vergleichbar stabile Faltung aller sechs Analoga. Die eisbindende Seite konnte wegen teilweise uneindeutiger Ergebnisse der Eisaktivitätsmessungen nicht eindeutig bestimmt werden. Moleküldynamik Simulationen zeigten, dass der Einfluss der Lysin-Seitenkette und der N-terminalen Acetyl-Schutzgruppe auf die Faltung stark positionsabhängig ist. Diese Ergebnisse werden durch die unterschiedlich hohen Mittelpunkte der thermalen Entfaltung, die für zwei Analoga spektroskopisch ermittelt wurden, bestätigt.

Außerdem wurden die Schalteigenschaften der Analoga in Abhängigkeit der Lysin-Position mit zwei lichtreaktiven, molekularen Schaltern ermittelt. Zwei Analoga wurden mit jeweils einem Azobenzol und einem ortho methylierten Azobenzol-Derivat funktionalisiert. Die Faltung der funktionalisierten Proteinchimären wurde spektroskopisch analysiert. In allen Fällen wiesen die Spektren auf Aggregation hin. Die Eisaktivität eines der funktionalisierten Analoga wurde für beide Isomere des Azobenzol-Schalters untersucht und tatsächlich wurde eine vollständige Inhibition des Eiskristallwachstums  über einen sehr geringen Temperaturbereich beobachtet. Dies trat jedoch für beide Isomere des Schalters auf, war in weiteren Belichtungszyklen nicht reproduzierbar und spricht ebenfalls für Aggregation der funktionalisierten Proteinchimäre.

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