Produktion funktionaler Pentamere des plasmodialen Lactattransportproteins PfFNT zur Strukturuntersuchung und phänotypischen Wirkstofftestung

Die von Parasiten der Gattung Plasmodium ausgelöste Malaria ist die beim Menschen weltweit am häufigsten auftretende Infektionskrankheit. Der pentamere Formiat-Nitrit-Transporter aus P. falciparum (PfFNT) vermittelt die Ausschleusung des Stoffwechselendprodukts Lactat. Die Blockade des PfFNT durch Malariabox-Substanzen wie MMV007839 und abgeleitete Inhibitoren führt zur zytotoxischen Acidifizierung und Lactatakkumulationen. Aufgrund der fehlenden strukturellen Ähnlichkeit zu humanen Lactattransportern wurde PfFNT als Wirkstofftarget charakterisiert. In P. falciparum-Parasitenkulturen wurden PfFNT-Resistenzmutanten wie PfFNTG107S und verringerter Suszeptibilität
gegenüber MMV007839 selektiert. Pentafluor-3-hydroxy-pent-2-en-1-one wie BH267.meta wurden entwickelt und stellen die Basis für neue Antimalariawirkstoffe dar. Hier wurde ein phänotypisches Hochdurchsatzwirkstoffscreening im Saccharomyces cerevisiae-Hefesystem validiert. Zu Strukturuntersuchungen von hochaufgelösten PfFNT-Inhibitor-Komplexen via Cryo-Elektronenmikroskopie wurden zellfreie und zellbasierte Expressionssysteme zur Produktion funktionaler PfFNT-Pentamere evaluiert. Die Rekonstitution in Nanodiscs wurde als Grundlage für Strukturuntersuchungen von stabilisierten PfFNT-Membranproteinen eingeführt. PfFNTG107S-Pentamere wurden durch Expression in S. cerevisiae- und Pichia pastoris funktional hergestellt und nach Membranproteinextraktion geringe Ausbeuten solubilisierter PfFNTG107S-Pentamere erhalten. Zur Umgehung dieser Limitationen wurden Post-Golgi-Vesikel in der S. cerevisiae-Sekretionsmutante NY17 angereichert. Durch das vereinfachte Extraktionsprotokoll wird die Befähigung der Hefezellsysteme zur PfFNT-Pentamerproduktion für zukünftige Strukturuntersuchungen von Membranproteinen mit gebundenen Inhibitoren zugänglich.

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