Neue analytische Verfahren zum Nachweis von mARC-Substraten
Im Fokus dieser Arbeit stand die Entwicklung eines Assays für das mARC-Enzymsystem, welcher im Mikrotiterplattenformat angewendet werden kann, um insbesondere Zeit- und Material einzusparen. Der Assay basiert auf der Vermessung der Eigenfluoreszenz von NADH, sodass auch die Vermessung farbiger Substanzen möglich ist, sofern diese nicht bei 465 nm fluoreszieren. Darüber hinaus ist die Anwendung im Hochdurchsatz-Screen denkbar, indem eine Übertragung auf größere Mikrotiterplattenformate (beispielsweise 384-well-Format) und die Zuhilfenahme eines Pipettierroboters durchgeführt wird. Mit diesem Assay konnten neben der Vermessung zahlreicher Substanzen weitere Substrate identifiziert und bekannte Substrate enzymkinetisch charakterisiert werden. Zudem konnte mit diesem Assay eine neue funktionelle Gruppe für das mARC-Enzymsystem, die nicht auf eine N-O-Bindung zurückzuführen ist, vermessen werden. Wasserstoffperoxid ist die erste Verbindung, anhand derer eine Reduktion einer O-O-Bindung durch das mARC-Enzymsystem nachgewiesen werden konnte. Weiterhin wurde die Reduktion von Hydroxyharnstoff zu Harnstoff genauer untersucht und es wurden erstmals übereinstimmende in-vitro und in-vivo-Daten für den Hydroxyharnstoff-Metabolismus aufgezeigt. Einige Substrate, wie Trimethylamin-N-Oxid werden mit nur sehr geringen Umsetzungsraten reduziert. Für die Beantwortung quantenmechanischer Fragestelllungen wurde das Enzymsystem gewechselt und die Reduktion von Trimethylamin-N-Oxid durch die bakterielle TMAO-Reduktase TorZ mit Hilfe des Methylviologen-Assays untersucht. In Abhängigkeit, ob eine, zwei oder alle drei Methylgruppen 13C-markiert vorliegen, konnten keine signifikanten enzymkinetischen Unterschiede detektiert werden, im Gegensatz zur theoretischen Vorhersage.
Preview
Rights
Use and reproduction:
No license. The provisions of the German Copyright Act (UrhG) apply.
Please note that individual components of the publication may be subject to other licensing or copyright conditions.