Struktur-Funktionsbeziehungen der ATPase-Domäne von ATP4 aus Plasmodium falciparum und Toxoplasma gondii

Eines der wenigen antiparasitären Wirkstofftargets stellt die Na+ /H+ -ATPase PfATP4 dar, welche von essentieller Bedeutung für den Parasiten ist. In der vorliegenden Arbeit wurden PfATP4 sowie das Homolog aus Toxoplasma gondii mithilfe der zellfreien Proteinsynthese in hohen Ausbeuten hergestellt, jedoch konnte der Funktionalitätsnachweis aufgrund der nicht erfolgreichen Rekonstitution in Proteoliposomen nicht erbracht werden. Als alternatives zellbasiertes Expressionssystem wurden Saccharomyces cerevisiae vom Stamm NY17 verwendet, in welchen die Enzyme erfolgreich hergestellt, aber nur mit inkonsistenter Effizienz aus der Membranfraktion isoliert werden konnten. PfATP4 konnte nachfolgend mit DDM in geringen Ausbeuten solubilisiert werden, TgATP4 hingegen nicht. Dennoch bildet das verwendete Hefesystem eine Grundlage für zukünftige Strukturuntersuchungen am isolierten Protein sowie für Transmembranstudien in Post-Golgi-Vesikeln. Die cytosolische Domäne von PfATP4 konnte erfolgreich in hohen Ausbeuten in Escherichia coli hergestellt werden. Mittels eines photometrischen PhosphataseAssays konnte eine Mg2+ - und substratabhängige Aktivität nachgewiesen werden, die der des nativen Proteins vergleichbar war. Demgegenüber zeigten veränderte Na+ - Konzentrationen keinen Einfluss auf die Funktion. Die Domäne konnte durch Natriumvanadat nur partiell inhibiert werden und wurde durch die Behandlung mit Cysteinmodifikatoren nicht beeinflusst. Durch ortsspezifische Mutagenese konnte der postulierte Einfluss konservierter Aminosäuren auf die Bindung von ATP sowie die Koordination von Mg2+ bestätigt werden. Eine Mutation in der putativen Phosphorylierungsstelle führte hingegen nicht zu einer Reduktion der enzymatischen Aktivität. Der etablierte Assay bildet eine vielversprechende Basis für zukünftige mechanistische Untersuchungen sowie Inhibitorscreenings am Gesamtprotein.

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