Biophysikalische Untersuchung von an Biotransformation beteiligten Flavinmonooxygenasen
Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Expression, Reinigung, Charakterisierung sowie der Kristallisation der ΔhFMO5, einer Variante der humanen Flavin-abhängigen Monooxygenase 5 (hFMO5), bei welcher die Transmembranhelix entfernt wurde. Diese Modifikation ermöglicht die Expression und Reinigung von löslichem Protein ohne Zugabe von Detergenz und resultiert in der Reinigung von aktivem, mit FAD gesättigtem Protein. Die zur Bildung von Aggregat neigende ΔhFMO5 konnte im Glasfermenter im Stamm E. coli Rosetta 2 (DE3) pLysS erfolgreich exprimiert, mittels enzymatischem Zellaufschluss lysiert und mit Affinitäts- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt werden. Die Charakterisierung mittels Massenphotometrie zeigt, dass die ΔhFMO5 in Lösung als ein Mix aus unterschiedlichen Oligomerisierungszuständen vorliegt. Dabei überwiegt der Zustand bestehend aus vier Untereinheiten. Der katalytische Zyklus der ΔhFMO5 beinhaltet einen entkoppelten Stoffwechselweg, bei welchem zur Regeneration des Kofaktors FAD ohne die Umsetzung von Substrat NADPH verbraucht wird und Wasserstoffperoxid entsteht. Die iterative Modellierung der Reaktionskinetik der ΔhFMO5 zeigt, dass die Verstoffwechselung von Substrat als Reaktion 2. Ordnung langsamer abläuft als die entkoppelte Reaktion. Die Messung der Aktivität zeigt, dass die Umwandlung von Phenylaceton zu Benzylacetat mit einer Umsetzungsrate von 5,1 % durch die ΔhFMO5 katalysiert wird. Als mögliches endogenes Substrat wurde N-Acetylserotonin ermittelt, welches eine Rolle in der Produktion von Melatonin und Serotonin spielt.
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