Isolation und Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus humanen CD8+- und γδ-T-Lymphozyten

Extrazelluläre Vesikel (EV) sind von einer Lipiddoppelschicht begrenzte, nicht-replikationsfähige Partikel, die von diversen Zellen in den extrazellulären Raum sezerniert werden. Hierbei umfasst der Überbegriff EV mehrere Subgruppen von Vesikeln, welche sich hinsichtlich Größe, Biogenese und molekularer Zusammensetzung unterscheiden. Zu diesen Subgruppen gehören u.a. Exosomen, Mikrovesikel und apoptotische Körperchen.

In der vorliegenden Arbeit wurden EV von zytotoxischen CD8⁺-T-Zellen und γδ-T-Zellen mittels differentieller Zentrifugation isoliert und mit verschiedenen Verfahren charakterisiert (NTA, Western Blot, Durchflusszytometrie, Massenspektrometrie). Zudem wurde der Einfluss einer kurzzeitigen Stimulation auf die EV-Freisetzung untersucht und die induzierte Vesikel-Produktion mit nicht stimulierten Kontrollgruppen nach zwei und 72 Stunden verglichen.  Mittels NTA wurde die Größe und Konzentration der EV in zahlreichen Kulturüberständen bestimmt. Die mittleren Durchmesser der freigesetzten EV lagen zwischen 167 und 191 nm. Die Stimulation der Zellen führte zu einer signifikanten Erhöhung der Vesikel-Freisetzung, verbunden mit gesteigertem Zelltod. Mittels Western Blot wurden in den EV-Proben die Tetraspanine CD63 und CD81 als EV-Marker nachgewiesen, ebenso das zytotoxische Effektorprotein Granulysin. 

Um die Proteinzusammensetzung der EV zu untersuchen erfolgte eine vergleichende Proteomanalyse mittels Tandem-Massenspektrometrie. Dabei konnten über 900 Proteine identifiziert und 686 Proteine quantifiziert werden. Die Daten der Massenspektrometrie belegten das Vorhandensein zahlreicher EV-spezifischer Marker, u.a. der Tetraspanine CD9 und CD81 sowie HSP70, Syntenin-1, TSG101 und ALIX. Insgesamt ergab sich ein weitgehend homogenes Spektrum an Proteinen in EV beider T-Zellpopulationen. Die Gen-Ontologie-Bewertung ergab eine deutliche Anreicherung von Proteinen, die mit extrazellulären Vesikeln und deren Biogenese, aber auch mit zytotoxischer Effektorfunktion assoziiert sind. Populations-spezifische Marker wie die jeweiligen T-Zell-Rezeptoren oder CD8 waren erwartungsgemäß unterschiedlich abundant.