Development and application of proteomics approaches for the elucidation of modes of actions of drugs

In der vorgelegten Arbeit wurden massenspektrometrische Proteomics Verfahren entwickelt und für die Analyse der Wirkung neuer Wirkstoffkandidaten aus dem marinen Pilz Pyrenochaetopsis sp. auf Melanomzellen angewendet. Mittels einer quantitativen Proteomanalyse wurden verschiedene Kultivierungsbedingungen für den Pilz untersucht um die Produktion von Wirkstoffen zu ermöglichen.
In einem weiteren Kapitel dieser Arbeit wurde eine Probenvorbereitungspipeline auf einem digitalen Mikrofluidik (DMF) System entwickelt, welche geeignet war um Proteomicsproben von weniger als 5000 Melanomzellen vorzubereiten. In Benchmark-Experimenten wurde gezeigt, dass die entwickelte
analytische Plattform geeignet war quantitative Veränderungen im Proteom zu beschreiben. Die Wirkung von Rohextrakten und isolierten Wirkstoffkandidaten aus Pyrenochaetopsis sp. auf das Proteom von A375 Zellen wurde mit der entwickelten Pipeline untersucht. Die Verbindung F18 (Phomasetin) wurde dabei als besonders wirksamer Kandidat charakterisiert, der in Melanomzellen bei einer Konzentration von ~5-10 μg/mL eine erhöhte Abundanz von Proteinen des Komplementsystems
zur Folge hatte. Es wurde im weiteren Verlauf der Arbeit versucht, ein Protokoll zur Charakterisierung von Proteintargets einzelner Wirkstoffe auf der DMF-Plattform zu etablieren. Zusätzlich wurde in einem Kapitel dieser Arbeit die quantitative Analyse von Proteoformen über iodoTMT optimiert. Dazu wurde die isobare Markierung cysteinhaltiger Proteoformen mit einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Trennung, der Elution mittels PEPPI und einer multi-CV-FAIMS-MS Methode kombiniert. Im Vergleich von E. coli Bakterien, die auf Acetat oder Glukose supplementiertem Minimalmedium kultiviert wurden, konnten 1614 Proteoformen quantifiziert werden. Dabei wurden signifikante Abundanzunterschiede z. B. für zwei Proteoformen der selenide, water dikinase beobachtet, die den gleichen Bereich der kanonischen Proteinsequenz abdeckten, sich jedoch durch eine Trioxidation eines Cysteins unterschieden. Diese Information ist durch klassische
bottom-up Proteomics nicht zugänglich und zeigt den Nutzen und die Relevant von quantitativen Proteoformdaten.