Molekularer Mechanismus der Fas Ligand-induzierten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase

Stephan, Mario

Das endo-lysosomale Enzym saure Sphingomyelinase (A-SMase) ist ein wichtiges Element der Todesrezeptor-vermittelten Apoptose. Im CD95-Signalweg ist die Translokation der A-SMase zur äußeren Zellmembran von besonderer Bedeutung. An der Zelloberfläche katalysiert die A-SMase die Hydrolyse von Sphingomyelin und ermöglicht die Bildung von Ceramid-angereicherten Membrandomänen. Dies bewirkt das Clustern des CD95-Rezeptors, eine verstärkte Rekrutierung der Adaptorproteine FADD und Caspase 8 sowie die Induktion einer apoptotischen, proteolytischen Kaskade. Jedoch ist bisher unbekannt, ob der A-SMase während der Rezeptor-Internalisierung eine weitere Funktion in der CD95-Signaltransduktion zukommt. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit die Internalisierung des CD95-Rezeptors zu analysieren und eine enzymatisch aktive A-SMase in den CD95-enthaltenden Endosomen (Rezeptosomen) nachzuweisen. Die magnetische Isolierung des zu unterschiedlichen Zeitpunkten internalisierten CD95-Rezeptors ermöglichte eine zeitabhängige Analyse der Rekrutierung von Adaptorproteinen. In der Western-Blot Analyse ließ sich mit dem verstärkten Auftreten von FADD und Caspase 8 die Bildung des DISC (death-inducing signaling complex) nachweisen. Die Detektion Kompartiment-spezifischer Markerproteine veranschaulichte zudem die Fusion zwischen CD95-Rezeptosomen und Rab 4A- oder Cathepsin D-positiven Vesikeln. Darüber hinaus ließ sich mit verschiedenen methodischen Ansätzen eine biphasisch aktivierte A-SMase in den magnetischen Fraktionen identifizieren. Der erste Aktivitätsanstieg korrelierte mit einer verstärkten Translokation der A-SMase an die Zelloberfläche und konnte durch den Caspase 8-Inhibitor IETD blockiert werden. Die Inhibition der CD95-Internalisierung durch den Dynamin-Inhibitor Dynasore reduzierte dagegen den zweiten Aktivitätsanstieg der A-SMase in den CD95-Rezeptosomen. Auf Grundlage dieser Inhibitionsversuche ließ sich das biphasische Aktivitätsprofil mit der Caspase 8-abhängigen Translokation der A-SMase zur Plasmamembran sowie mit der anschließenden CD95-Internalisierung in Verbindung setzen. Interessanterweise führte auch die Behandlung mit dem Caspase 3/7-Inhibitor DEVD zu einer Inhibition des zweiten Aktivitätsanstiegs der A-SMase. Weitere Analysen zeigten, dass Caspase 3 und 7 in den CD95-Rezeptosomen angereichert sind und direkt mit der A-SMase interagieren. In vitro ließ sich zudem die Caspase 3- und 7-vermittelte proteolytische Aktivierung der A-SMase nachweisen. Diese Ergebnisse lassen somit darauf schließen, dass der zweite Aktivitätsanstieg der A-SMase auf einem Caspase 3- oder 7-abhängigen Aktivierungsmechanismus in internalisierten CD95-Rezeptosmen beruht.

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Stephan, Mario: Molekularer Mechanismus der Fas Ligand-induzierten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase. 2013.

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