Aufklärung verschiedener Glukoseabbauwege und deren Einfluss auf den Wasserstoffmetabolismus im Cyanobakterium Synechocystis spec. PCC 6803

Schreiber, Karoline

Das Cyanobakterium Synechocystis spec. PCC 6803 produziert Photowasserstoff im Licht und fermentativen Wasserstoff im Dunkeln. In dieser Arbeit wurde die Elektronenübertragung zweier bakterieller Ferredoxinen auf die Hydrogenase untersucht. Die Mutante, in der fdx9 ausgeschaltet wurde, zeigte eine geringere Photowasserstoffproduktion im Vergleich zum Wildtyp. Fermentativer Wasserstoff wird im Dunkeln auf Kosten des Abbaus von Glykogen bzw. Glukose erzeugt. Bisher waren zwei Glukoseabbauwege in Synechocystis bekannt, der Embden-Meyerhoff-Parnass- (EMP, oder Glykolyse) und der Oxidativer-Penthose-Phoshat- (OPP) Weg. In dieser Arbeit konnte die, dem Enter-Doudoroff-Weg (ED) zugehörige, potentielle KDPG-Aldolase (Eda/sll0107) komplett und die potentielle 6-P-Glukonat-Dehydratase (Edd(sll0452) teilweise aus dem Genom von Synechocystis deletiert werden. Beide Mutanten zeigten einen ausgeprägten Phänotyp im Wachstum unter mixotrophen Bedingungen (im Dauerlicht unter Zugabe von Glukose). Die potentielle KDPG-Aldolase aus Synechocystis wurde in Synechocystis überexprimiert und isoliert. Das Enzym setzte KDPG mit einem KM-Wert von 0,095 zu Pyruvat um. Zusammengenommen, weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass der ED-Weg in Synechocystis abläuft und hier als Glukoseabbauweg lange übersehen wurde. Datenbankrecherchen unserer Arbeitsgruppe hatten ergeben, dass potentielle Gene für das Schlüsselenzym des ED-Weges (die KDPG-Aldolase) und edd auch in Pflanzengenomen weit verbreitet sind. Aus diesem Grund wurde die potentielle KDPG-Aldolase aus Gerste (Hordeum vulgare) in E. coli überexprimiert und isoliert. Sie setzte KDPG mit einem KM-Wert von 0,35 zu Pyruvat um. Gerste verfügt damit wie Synechocystis über eine funktionelle KDPG -Aldolase. Erste Wasserstoffmessungen mit verschiedenen Mutanten, in denen entweder der ED-, der EMP- oder der OPP-Weg unterbrochen war, zeigte, dass insbesondere der OPP-Weg eine Rolle für die fermentative Wasserstoffproduktion spielen könnte.

The cyanobacterium Synechocystis spec. PCC 6803 produces photohydrogen in the light and fermentative hydrogen in the dark. Photohydrogen production is directly linked to the photosynthetic electron transport. This study focuces on two bacterial-type ferrodoxins as electron carriers to the hydrogenase. In comparison to the wild-type, the Fdx9 deletion mutant showed less photohydrogen production. Fermentative hydrogen is produced in the dark at the expense of glycogen respectively glucose. So far, two ways of glucose degradation were known in Synechocystis, the EMP- (Embden-Meyerhof-Parnas, or glycolysis) and OPP- (oxidative penthose-phosphate) pathway. To investigate which pathway is of importance for fermentative hydrogen production, the central carbon metabolism was examined in detail. In this work we were able to delete potential enzymes of the Entner-Doudoroff- (ED)-pathway KDPG-aldolase (eda) completely and edd partially from the genome of Synechocystis. Both mutants showed a distinct phenotype in growth under mixotrophic conditions (continuous light with the addition of glucose). The potential KDPG aldolase from Synechocystis was overexpressed and purified from Synechocystis. The enzyme turned KDPG to pyruvate with a KM-value of 0.095. These results indicate that the ED-way exists in Synechocystis and has been previoesly long overlooked as a pathway of glucose degradation. Database search in our working group had shown that potential genes for the key enzyme of the ED-pathway (the KDPG-aldolase) and Edd are widespread in plant genomes as well. For this reason, the potential KDPG-aldolase was overexpressed from barley (Hordeum vulgare) in E. coli and purified (KM-value of 0.35). Thus, like Synechocystis, barley has a functional KDPG-aldolase. First hydrogen measurements with different mutants in which either the ED-, the EMP- or the OPP-pathway was interrupted, showed that particularly the OPP-pathway could play a role for the fermentative hydrogen production.

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Schreiber, Karoline: Aufklärung verschiedener Glukoseabbauwege und deren Einfluss auf den Wasserstoffmetabolismus im Cyanobakterium Synechocystis spec. PCC 6803.

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