Phospholipase D3 (PLD3), biochemische Charakterisierung und Bedeutung bei der Prozessierung des Amyloid-Precursor-Proteins

Jagdmann, Sebastian ORCID

Zur Analyse der Phospholipase D3 wurden molekularbiologische, zellbiologische und biochemische Methoden eingesetzt. Außerdem wurde ein anti-PLD3-Antikörper experimentell etabliert, der den kurzen N-Terminus spezifisch detektiert. Nach der bisherigen, geringen Studienlage handelt es sich bei der Phospholipase D3 um ein Membranprotein, welches maßgeblich mit dem Endoplasmatischen Retikulum assoziiert ist (Munck et al. 2005), wobei neuere Studien auf eine Verbindung mit Lysosomen weisen (Palmieri et al. 2011). In dieser Arbeit kann gezeigt werden, dass PLD3 zellulär in Endosomen/Lysosomen lokalisiert ist. PLD3 wird proteolytisch in Lysosomen gespalten, wobei N- sowie C-terminale PLD3-Fragmente neu beschrieben werden konnten. Die Phospholipase D3 besteht in vitro überwiegend in der löslichen, luminalen Form. Weiterhin kann gezeigt werden, dass PLD3 an verschiedenen Positionen der AS-Sequenz mit unterschiedlichen Zuckertypen N-glykosidisch konjugiert ist. PLD3 wird nicht über Mannose-6-Phosphat-Reste sortiert. Auch dem potentiellen N-terminalen Tyrosin-Sortierungsmotiv kommt nur eine untergeordnete Rolle bezüglich des lysosomalen PLD3-Transportes zu und es werden alternative Transportmechanismen diskutiert. Zur Analyse einer potentiellen katalytischen Funktion von PLD3 als Phospholipase D wurde ein Enzym-Aktivitäts-Assay etabliert, welcher eine mögliche pH-Abhängigkeit der Aktivität berücksichtigt. Unter Testbedingungen kann eine enzymatische Aktivität von PLD3 im neutralen Milieu nachgewiesen werden. Die Phospholipase D3 wurde mit dem Retromer-Komplex in Verbindung gebracht (Breusegem und Seaman 2014). Passend kann gezeigt werden, dass PLD3 mit einer essentiellen Untereinheit des Retromer-Komplexes endosomal kolokalisiert, wodurch eine funktionelle Beteiligung der Phospholipase D3 bei der Formierung und Abschnürung retrograder Vesikel denkbar ist. Durch die PLD3-Überexpression in neuronalen Zellen können die APP-Gesamtlevel teils signifikant reduziert werden, in Zusammenschau mit der Analyse von PLD3-Kockout-Zellen ist der Einfluss auf das APP-Volllängenprotein jedoch als mäßig zu werten. PLD3 hat eher einen Effekt auf die proteolytische Prozessierung von APP, wobei die nicht-amyloidogene Spaltung gefördert und insgesamt geringere zelltoxische Abeta-Mengen generiert werden könnten. Außderdem wurde die murine Variante der wichtigsten PLD3-Patientenmutation (PLD3-V232M) mikroskopisch analysiert. Diese zeigt sich unter Überexpression, abweichend vom Wildtyp, überwiegend ER-lokalisiert. Ein pathologischer Transport mit konsekutivem Funktionsverlust von PLD3-V232M könnte eine zellbiologische Erklärung für die beschriebene Assoziation mit der Spätform des M. Alzheimer (Cruchaga et al. 2014) sein.

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Jagdmann, Sebastian: Phospholipase D3 (PLD3), biochemische Charakterisierung und Bedeutung bei der Prozessierung des Amyloid-Precursor-Proteins. 2020.

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