Charakterisierung neuer Substrate der Aspartatprotease Cathepsin D nach Stimulation des TNF-Rezeptors 1

Klawitter, Jan

Apoptose ist durch eine Vielzahl von externen und internen Stimuli auslösbar. Im Bereich externer Stimuli führt eine Bindung des Liganden Tumornekrosefaktor alpha (TNF) an seinen spezifischen Rezeptor TNFR1 auf der Oberfläche von Zellen der U937-Zelllinie zur Rezeptorinternalisierung und weiter zu einer Fusion als Rezeptosom mit dem MVB. Nach Aktivierung spaltet die Aspartatprotease Cathepsin D beispielsweise das mitochondriale Protein bid in seine trunkierte Form tbid. Über Cytochrom-c-Freisetzung und sich anschließende Apoptosombildung wird der intrinsische Weg der Apoptose transduziert. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit besteht in der Charakterisierung neuer Substrate der Aspartatprotease Cathepsin D. Zellen der humanen histiozytären U937-Zelllinie wurden nach Vorabeiten an Cathepsin D-defizienten MEF-Zellen exogen mit TNF stimuliert. Dabei zeigte sich für das Hitzeschockprotein HSP90 ein Aufkommen massenspektrometrisch charakterisierter Spaltfragmente. Das Aufkommen dieser Fragmente war nach Anwendung des Aspartatproteaseinhibitors Pepstatin A reversierbar. Für das Chaperonin TCP1 alpha wurde eine vollständige Degradation angenommen, da keine Spaltfragmente entstanden waren. Pepstatin A führte hier zu keiner signifikanten Inhibition der Degradation. Versuche, die Proteinexpression durch Transfektion von U937-Zellen mit siRNA und shRNA zu inhibieren gelangen nicht. Hierzu wurde abschließend ein CRISPR/Cas9- Plasmid verwendet, wodurch eine stabile Transfektion ermöglicht werden konnte.

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Klawitter, Jan: Charakterisierung neuer Substrate der Aspartatprotease Cathepsin D nach Stimulation des TNF-Rezeptors 1. 2018.

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